吉非替尼获得性耐药细胞株对不同化疗药物的敏感性分析

目的 探讨吉非替尼获得性耐药细胞株对不同化疗药物的敏感性,为分子靶向治疗失败的患者选择化疗方案提供临床前的依据.方法 体外培养人肺腺癌细胞株PC9和吉非替尼获得性耐药株PC9/G,采用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法测定PC9和PCg/G细胞对不同药物的敏感性以及细胞的增殖抑制率;采用流式细胞仪检测药物对PC9和PCg/G细胞凋亡的影响及P-170蛋白的表达;采用基因芯片技术分析PC9和PC9/G细胞的表达基因谱差异;采用Western blot法检测PC9和PC9/G细胞中总Akt、磷酸化Akt和整合素β1的表达.结果 MTT和凋亡检测的结果 表明,与PC9细胞相比,吉非替尼获得性耐药细胞株PC9/G对顺铂的耐药指数为5.4,细胞凋亡减少,联合LY294002后对顺铂的敏感性显著增加(P＜0.05).PC9/G细胞对多西紫杉醇较PC9细胞更为敏感,培美曲塞对两株细胞的IC50及凋亡影响的差异无统计学意义(P＞0.05).PC9/G细胞中P-170蛋白的表达水平为5.32,与PC9细胞(7.18)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).基因芯片分析显示,PC9/G细胞中,整合素β1及DNA修复基因的表达上调,有丝分裂期基因表达下调.PC9/G细胞中总Akt、磷酸化Akt及整合素β1的蛋白表达水平分别为1.32、1.82和1.59,PC9细胞巾总Akt、磷酸化Akt及整合素β1的蛋白表达水平分别为0.83、0.87和0.57.结论 在吉非替尼获得件耐药细胞株中存在P13K的表达上调及激活、整合素β1及DNA修复基因的表达上调,其表达土调与顺铂耐药相关;表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗失败的患者在选择化疗方案时应避免使用铂类药物,可选择给予多西紫杉醇或培美曲塞治疗.     

ID1对非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药的影响

背景与目的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是当今世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,而表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EG-FR-TKI）整体有效率为30%-40%,无进展生存期（progression-free survival, PFS）为12个月。但EGFR-TKI在临床中的耐药现象也很普遍,严重影响了其抑瘤作用。因此,克服耐药、寻找一种新的与肺癌耐药相关的预后因子势在必行。本研究旨在通过体内外实验探讨DNA结合抑制因子1（differentiation inhibitory factor 1, ID1）与NSCLCEGFR-TKI耐药之间的关系,看其是否有统计学意义,并初步探讨其机制。方法免疫组化（immunohistochemistry, IHC）检测手术标本（肺癌组织和癌旁组织）1D1的表达;qRT-PCR、Western-blot检测并比较肺癌细胞敏感株与耐药株中ID1的表达变化;MTT检测吉非替尼对ID1慢病毒载体处理肺癌细胞的细胞增殖情况,将肺癌细胞接种至裸鼠腋下,待肿瘤生长至一定体积使用吉非替尼治疗,估算肿瘤体积。结果 ID1在肺癌组织中的表达明显高于正常组织（P<0.05）;ID1的表达与NSCLC EGFR-TKI耐药呈正相关（P<0.05）。结论 ID1在NSCLC中高表达,并且参与了NSCLC EGFR-TKI的耐药,其机制可能与STAT3磷酸化程度增加有关。     

靶向血管新生肽修饰的氧化铁纳米粒对荷瘤裸鼠磁热疗的研究

目的:制备一种具有靶向新生血管特点的葡聚糖包覆超顺磁性氧化铁纳米粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs),观察其与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的亲和力以及对肿瘤组织的靶向结合能力,观察在外加交变电场条件下对荷瘤裸鼠进行肿瘤局部磁热疗的效果.方法:采用化学共沉淀法制备葡聚糖包覆的SPIONs,并将其共价偶联靶向血管新生肽RGD10,命名为RGD-SPIONs.电子显微镜下观察RGD-SPIONs的形态,纳米粒度分析仪检测其大小,原子吸收分光光度计法检测铁含量,与细胞和组织结合后利用普鲁士蓝法进行铁染色鉴定.在外加交变电场的条件下,观察RGD-SPIONs对HUVECs的热杀伤作用,以及静脉注射后对荷瘤裸鼠进行肿瘤局部磁热疗的效果.结果:RGD-SPIONs形态近似圆形,直径为30～40 nm,核心铁颗粒直径为8～10 nm,铁含量为(1.71±0.16) g/L.SPIONs利用RGD肽与整合素的亲和力结合在HUVECs表面,其结合率为(54.4±8.2)%,用交变电场处理后,显示有(38.4±9.8)% HUVECs发生凋亡.小鼠肿瘤冰冻组织切片观察发现,RGD-SPIONs与肿瘤组织有较好的亲和力.局部热疗后荷瘤小鼠的抑瘤率为54.8%,与对照比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论:RGD-SPIONs在大小和性能上符合热疗要求,与HUVECs有较好的亲和力,具有肿瘤组织靶向结合能力,局部热疗后对肿瘤生长具有一定的抑制作用.     

131 I 标记血管靶向分子在肿瘤显像中的应用

 目的 研究¹³¹ I 标记的血管靶向分子（RGD10、F56、K237）的生物活性及在肿瘤部位的浓聚情况。方法 采用Iodogen法标记血管靶向分子,用Sep-PakC18柱纯化,通过HUVEC检测它们的免疫活性分数和亲和常数,用手持式丫相机检测和比较它们在荷A549肺腺癌裸鼠肿瘤部位的浓聚情况。结果 ¹³¹ I RGD10、¹³¹ I F56、¹³¹ Ⅰ-K237的免疫活性分数（IRF）分别为42．7％、55．1％和44．5％,与HUVEC的亲和常数Ka值分别为9．41×10⁷L／m01、3．87×10⁷L／mol和5．98×10⁷L／mol。3个¹³¹ I 标记的血管靶向分子中,¹³¹ I -RGD10在肿瘤部位的浓聚效果更为明显。结论 静脉注射¹³¹ Ⅰ-RGD10在肿瘤部位聚集,可望成为肿瘤早期核素显像诊断靶向分子。     

非小细胞肺癌EGFR基因第19外显子突变的特征分析

吉非替尼(gefitinib)是针对肺癌表皮生长因子受体(epiddermal growth factor receptor,EGFR)设计的肿瘤靶向药物,已使众多的非小细胞肺癌(NSCLC)患者获益,但其疗效与EGFR基因突变相关[1-3].通过EGFR基因第19外显子可筛选gefitinib药物的最适合患者进行个体化治疗,提高疗效,减少盲目用药.我们检测了62例NSCLC患者的EGFR基因第19外显子突变,并分析突变DNA特征及氨基酸变化规律.     

吉非替尼耐药细胞株的筛选和基因谱表达研究

目的：从对吉非替尼（gefitinib）敏感的肺腺癌细胞株PC9中筛选并建立了6株gefitinib耐药细胞亚克隆并研究其生物学特性。方法：采用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）诱变筛选和有限稀释法进行耐药性亚克隆的单细胞培养,MTT法检测肿瘤细胞对gefitinib的敏感性和IC50,DNA微列阵检测耐药细胞株与野生型PC9细胞的基因表达差异,免疫组织化学法测定细胞外间质成分fibronectin和collagenⅣ的表达差异,FCM法进行细胞周期分析。结果：获得了对gefitinib具有较高耐药性的2个细胞株：PC9/G2和PC9/G4,尤其PC9/G2的IC50为7～10μmol/L,较野生型PC9细胞（IC50：0.03～0.05μmol/L）提高耐受性160～260倍。PC9的细胞倍增时间为（16.2&#177;3.5）h,PC9/G2的倍增时间为（36.5&#177;4.8）h。PC9/G2同PC9的基因表达谱存在明显差异,耐药细胞株PC9/G2的脂肪酸代谢和氧化磷酸化基因表达下降,糖酵解基因表达上升,核糖体各亚基蛋白表达下调,高尔基体和囊泡、笼形蛋白衣被小泡等相关基因表达上调,细胞蛋白分泌功能加强;泛素-蛋白酶体循环相关基因上调;DNA修复基因和解旋酶类基因表达上调;具有蛋白激酶活性的30个基因表达上调,11个基因表达下调;15个磷酸化蛋白磷酸酶活性的基因表达上调;具有GTP结合活性的基因21个表达上调,4个下调;涉及细胞骨架和细胞运动功能的8个基因上调;整合素β1亚基、类胰岛素受体、NFκB级联反应的正向调节因子表达上调。结论：成功建立了6株PC9细胞的gefitinib耐药细胞株,初步研究表明对gefitinib中度耐药可能与细胞外基质组分改变及其黏附信号通路有关,对gefitinib高度耐药则可能涉及替代性信号通道的激活和信号通道的下游激活。     

cRGD-氧化铁纳米粒的构建及应用于核磁共振成像诊断中的动物研究

目的:构建肿瘤靶向的核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)阴性造影剂纳米粒,并初步探讨其在肿瘤MRI中的应用.方法:化学共沉淀一步法制备超小型超顺磁性氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO)纳米粒.采用化学交联法将含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)序列的环形短肽(cyclic RGD, cRGD)与USPIO共价结合,制备具有整合素α靶向作用的超顺磁性造影剂,并对其进行理化性质的检测.采用普鲁士兰染色法检测cRGD-USPIO和USPIO与人肺腺癌A549细胞及人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的特异性结合能力.建立A549裸鼠移植瘤模型,尾静脉注射USPIO和cRGD-USPIO,行MRI检测,评价cRGD-USPIO对肿瘤MRI信号增强的作用.结果:成功制备获得cRGD-USPIO纳米粒,其核心纳米粒径为5～10 nm,平均粒径为(43.97±10.10)nm,比饱和磁化强度为59.94 A·m~2·kg~(-1).细胞结合实验结果提示,与USPIO组比较,cRGD-USPIO组阳性染色明显增强.动物体内MRI诊断结果显示,与USPIO组比较,cRGD-USPIO组肿瘤信号明显降低(P<0.01).结论:构建的靶向性超顺磁性氧化铁纳米粒可能成为一种新型的、具有肿瘤早期诊断特异性的MRI阴性造影剂.     

血管内皮生长因子C过表达或抑制表达对人小细胞肺癌NCI-H446细胞生物学行为的影响

目的:探讨血管内皮生长因子C (vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)对人小细胞肺癌细胞株NCI-H446生长、体外侵袭和细胞凋亡的影响.方法:构建VEGF-C过表达慢病毒质粒pHRi-VEGF-C和小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)慢病毒表达质粒pHRi-siVEGF-C,经慢病毒包装后分别感染NCI-H446细胞.蛋白质印迹法检测VEGF-C的表达水平,MTT方法检测细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞体外侵袭能力,FCM检测细胞凋亡比例.结果:与空载体对照组相比,pHRi-VEGF-C质粒感染入NCI-H446细胞后VEGF-C基因表达水平显著升高,而pHRi-siVEGF-C质粒感染后VEGF-C基因表达水平显著降低.pHRi-VEGF-C质粒感染第5天后,NCI-H446细胞增殖(D值=1.481±0.056)明显高于pHRi-siVEGF-C组(D值=0.838±0.035)和空载体对照组(D值=1.146±0.07),差异有统计学意义(P＜0.05); pHRi-siVEGF-C组中每个视野侵袭的细胞平均数为39.78±0.77,显著低于pHRi-VEGF-C组的84.87±1.27和空载体对照组的60.82±1.05,差异有统计学意义(P＜0.01).感染了pHRi-VEGF-C质粒后的NCI-H446细胞凋亡数较空载体对照组减少约90％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:VEGF-C过表达可以显著促进NCI-H446细胞增殖,增强其侵袭能力,抑制细胞凋亡;而VEGF-C表达经RNA干扰后可以显著减缓细胞的增殖趋势,降低NCI-H446细胞的侵袭能力.推测VEGF-C可能成为临床治疗小细胞肺癌的基因治疗靶点之一.     

非小细胞肺癌细胞外基质中Co Ⅳ、Fn、Ln的表达及与化学敏感性和凋亡之间的关系

目的研究细胞外基质蛋白中Ⅳ型胶原蛋白、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其与细胞粘附、增殖、凋亡和药物敏感性之间的关系。同时探讨磷脂酰肌醇-3-激酶在肺癌Ⅳ型胶原蛋白信号传导中的作用。方法用免疫组化二步法(Envision’s)检测细胞外基质,用亚甲兰染色法记数粘附的细胞,用MTT法检测细胞增殖等,用Annexin V／PI检测细胞凋亡。结果在NSCLC基质中Ⅳ型胶原蛋白的表达率最高(93％)。Ⅳ型胶原蛋白包被后,NSCLC的细胞粘附性增加,顺铂的细胞毒性作用减弱,细胞存活率和增殖率显著高于对照组(P＜0.05)。磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂LY294002不仅降低细胞存活率(82.7± 2.0％)和细胞增殖率(75.2±6.8％)；也降低Ⅳ型胶原蛋白包被后的细胞存活率(92.2±2.8％)和细胞增殖率(84.6±9.2％)；并一定程度协助DDP增加了细胞凋亡。结论 NSCLC中存在ECM重构,Ⅳ型胶原蛋白保护NSCLC免受顺铂诱导的细胞凋亡,减弱了顺铂的增殖抑制作用。磷脂酰肌醇- 3-激酶的信号途径可能是Ⅳ型胶原蛋白诱导凋亡障碍和耐药的重要机制。