BVDV-1 VLPs的构建及免疫原性研究北大核心CSCD

目的利用C、E0、E1和E2蛋白构建BVDV病毒样颗粒,并评价BVDV-1 VLPs的免疫原性。方法以BVDV-BA株为模板通过反转录得到C、E0、E1和E2基因,再将C、E0、E1和E2基因分别克隆至PEASY-Blunt Simple克隆载体上。提取质粒摇菌扩大培养,将得到的C、E0、E1和E2基因克隆至杆状病毒穿梭载体pFast Bac HTA中,采用热激法将重组穿梭质粒转化至DH10.Bac大肠埃希菌感受态细胞,通过蓝白斑筛选技术获得重组杆粒rB-C、rB-E0、rB-E1和rB-E2。将重组杆粒转染至SF9细胞,获得重组杆状病毒;再用构建的4种重组杆状病毒同时感染SF9悬浮细胞,72 h后收集细胞沉淀进行超声破碎,利用蔗糖垫超速离心和蔗糖密度梯度离心进行纯化,通过Western blot和透射电镜进行鉴定。将获得的BVDV-1 VLPs联合氢氧化铝佐剂免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体水平评价VLPs的免疫原性。结果成功克隆出C、E0、E1和E2基因,并构建C、E0、E1和E2蛋白的杆状病毒。通过纯化和鉴定,在20%~30%蔗糖层获得由C、E0、E1和E2蛋白组成结构完整的病毒样颗粒BVDV-1 VLPs。BVDV-1 VLPs能够显著增加免疫小鼠的特异性抗体表达水平。结论构建并获得了由C、E0、E1和E2蛋白组成,并具备良好免疫原性的病毒样颗粒BVDV-1 VLPs。     

新型冠状病毒PLpro的克隆、表达及其对抗病毒天然免疫反应的调节作用北大核心CSCD

目的探讨新型冠状病毒(SARS-CoV-2)木瓜样蛋白酶(PLpro)对Ⅰ型干扰素免疫应答的调节作用。方法基于新型冠状病毒PLpro利用MEGA7.0构建SARS-CoV-2 PLpro进化树,并进行同源性分析;PCR扩增PLpro基因,并克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-PLpro。转染293细胞,采用Western blot和间接免疫荧光试验验证pcDNA3.1-PLpro的表达。通过qRT-PCR分析PLpro对Poly (I:C)刺激下炎性细胞因子mRNA表达的影响;双荧光素酶报告基因试验检测PLpro对IFN-β通路的影响。结果 SARS-CoV-2 PLpro蛋白序列与SARS PLpro相似性为82.7%,与蝙蝠冠状病毒PLpro相似性为96.8%。PCR扩增出PLpro目的基因片段长度为957 bp,与预期相符合,并在293细胞中表达。PLpro抑制IFN-β荧光素酶活性,同时抑制Poly (I:C)刺激引起的IFN-α、IFN-β、IL-6 mRNA表达升高。结论 SARS-CoV-2的PLpro抑制宿主细胞Ⅰ型干扰素免疫应答,为病毒逃逸宿主天然免疫反应提供有利条件。     

携带凋亡素的重组腺病毒激活AMPK诱导人膀胱癌EJ-1细胞S期阻滞

目的 探讨携带凋亡素(Apoptin)的重组腺病毒Ad-VT对人膀胱癌EJ-1细胞的杀伤作用及其细胞周期调节机制.方法 取对数生长期的EJ-1细胞分别给予不同感染剂量的腺病毒载体对照(Ad-T)或Ad-VT处理,通过CCK-8法和克隆形成实验检测Ad-T和Ad-VT对EJ-1细胞增殖活力的影响;流式细胞术检测细胞周期分布;Western印迹检测S期调控蛋白CDK2、CyclinA2和p21,以及通路蛋白腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和p-AMPK的表达水平.结果 Ad-T和Ad-VT显著降低EJ-1细胞存活率,诱导EJ-1细胞S期阻滞,伴p21蛋白表达增加、CyclinA2和CDK2蛋白表达降低等S期检查点改变,且Ad-VT作用强于Ad-T.Ad-T和Ad-VT显著上调p-AMPK蛋白表达,AMPK抑制剂Dorsomorphin逆转了Ad-T和Ad-VT所致EJ-1细胞S期阻滞,而过表达AMPK处理促进了上述变化.结论 Ad-VT具有抗膀胱癌作用,通过腺病毒载体和Apoptin两方面作用激活AMPK蛋白诱导人膀胱癌EJ-1细胞S期阻滞.