PRRSV体外感染原代猪肺泡巨噬细胞上调IFITMs分子mRNA转录水平的研究北大核心CSCD

目的检测PRRSV病毒体外感染原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)对猪源IFITM分子mRNA转录水平的影响。方法无菌采集PRRSV、PCV2和JEV阴性仔猪肺脏,分离PAM并用PRRSV病毒接种感染。于感染后不同时间点收集细胞,采用PCR检测PAM细胞PRRSV感染情况,采用荧光定量PCR检测PRRSV在PAM细胞中的复制情况以及IFITM分子mRNA的转录水平变化。结果成功分离到猪原代PAM细胞,接种PRRSV后出现明显的细胞病变。荧光定量PCR检测结果显示,PRRSV感染12 h后可显著上调PAM细胞中IFITM1、IFITM2和IFITM3 mRNA的转录水平,分别在感染后的第36 h、24 h和36 h达到高峰。结论 PRRSV体外感染PAM可显著上调猪IFITM mRNA转录,表明IFITM参与宿主抗PRRSV天然免疫反应,为揭示抗PRRSV天然免疫反应机制提供了理论依据。     

内蒙古东部部分奶牛场奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定及毒力基因检测北大核心CSCD

目的检测内蒙古东部奶牛场奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌感染情况,并鉴定其毒力基因携带情况。方法采集61份临床型乳房炎奶牛的牛奶样品进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定。利用PCR方法检测分离株金黄色葡萄球菌的nuc、clfA、fnbA、fnbB、tsst-1、sea、seb、sec、sed、seg、see、seh、sei、和sej 14种毒力基因,并对其中1株进行16S rRNA基因序列分析、生化检测、药敏试验以及动物致病性试验。结果成功分离到20株金黄色葡萄球菌。从分离菌中共检测到11种毒力基因,其中nuc、clfA、fnbB、sea、sed、sei 6种毒力基因检出率均超过50%。随机挑选1株分离菌,将其命名为TLXG01。16S rRNA基因序列分析显示,分离菌与已报道的MF511713.1 H2处于同一分支且相似度均高于99%。药敏敏验显示,该分离菌对14种常用抗生素敏感,对多粘菌素和链霉素耐药。动物致病性试验显示,该分离株对小鼠具有较强的致病性。结论内蒙古东部5个奶牛场乳房炎奶牛均有金黄色葡萄球菌感染,该病原菌携带毒力基因的数量和种类不同,且存在多种毒力基因组合,可为当地奶牛场奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎的防治提供参考。     

应用不同表达载体表达欧洲型PRRSV ORF5蛋白的研究北大核心CSCD

目的构建多种欧洲型PRRSV GP5蛋白原核表达载体,并比较其在大肠埃希菌中的表达效率。方法参考GenBank发表的欧洲型PRRSV LV株(GenBank登录号:M96262)ORF5序列,通过序列分析,设计合成ORF5全基因序列扩增引物及信号肽缺失引物。构建原核表达质粒pET-28a-GP5、pET-28a-gGP5、pET-22b-GP5、pET-22b-gGP5、pET-32a-GP5、pET-32a-gGP5、pGEX-4T-GP5、pGEX-4T-gGP5,经IPTG诱导后采用SDS-PAGE电泳分析GP5蛋白在各个原核表达载体的表达情况。结果 pET-28a-gGP5、pET-22b-gGP5、pET-32a-gGP5均没有高效的表达出缺失信号肽的GP5蛋白,缺少信号肽的GP5蛋白在pGEX-4T-1载体中高效表达,目的蛋白分子质量单位为42ku,与理论值相符。没有缺失信号肽的GP5蛋白在pET-28a-GP5、pET-22b-GP5、pET-32a-GP5、pGEX-4T-GP5,均未得到高效表达。结论本实验构建的重组原核表达载体pGEX-4T-gGP5能在大肠埃希菌中高效表达欧洲型PRRSV GP5蛋白,为进一步分析该蛋白的抗原性奠定了基础。     

应用不同表达载体表达欧洲型PRRSVORF5蛋白的研究

目的构建多种欧洲型PRRSVGP5蛋白原核表达载体,并比较其在大肠埃希菌中的表达效率。方法参考GenBank发表的欧洲型PRRSVLV株（GenBank登录号：M96262）ORF5序列,通过序列分析,设计合成ORF5全基因序列扩增引物及信号肽缺失引物。构建原核表达质粒pET-28a—GP5、pET-28a—gGP5、pET-22b—GP5、pET-22b—gGP5、pET-32a—GP5、pET-32a—gGP5、pGEX-4T—GP5、pGEX-4T—gGP5,经IPTG诱导后采用SDS—PAGE电泳分析GP5蛋白在各个原核表达载体的表达情况。结果pET-28a—gGP5、pET-22b—gGP5、pET-32a—gGP5均没有高效的表达出缺失信号肽的GP5蛋白,缺少信号肽的GP5蛋白在pGEX-4T-1载体中高效表达,目的蛋白分子质量单位为42ku,与理论值相符。没有缺失信号肽的GP5蛋白在pET-28a—GP5、pET22b—GP5、pET-32a—GP5、pGEX-4T—GP5,均未得到高效表达。结论本实验构建的重组原核表达载体pGEX-4T—gGP5能在大肠埃希菌中高效表达欧洲型PRRSVGP5蛋白,为进一步分析该蛋白的抗原性奠定了基础。     

猪圆环病毒3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

目的建立针对PCV3的操作简单、重复性好、灵敏度较高的检测方法。方法利用PCR方法扩增PCV3保守区基因片段(312bp),将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-PCV3作为阳性标准品质粒。优化反应条件,建立定量检测PCV3的实时荧光定量PCR方法,并进行敏感性、特异性和重复性验证。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法的Ct值与标准品模板在4.24×10~1~4.24×10~8拷贝/μl范围内呈良好线性关系,其相关系数为0.996,斜率为-4.384。该方法特异性强,与PRRSV、FMDV、JEV、PCV2及PRV均无交叉反应;敏感性为4.24×10~1拷贝/μl,比常规PCR方法高10倍;组间和组内重复试验的变异系数均小于2%。利用实时荧光定量PCR方法对采集的155份猪肺组织进行检测,阳性率为36.13%,高于普通PCR阳性检出率的32.25%。结论建立的PCV3SYBR GreenⅠReal-time PCR方法敏感、特异,可用于猪体PCV3感染的快速检测。