日本血吸虫可溶性虫卵抗原诱导 小鼠巨噬细胞凋亡机制

目的　观察日本血吸虫感染过程中巨噬细胞数量及其凋亡动态变化,并探讨血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）诱导巨噬细胞凋亡的可能机制。方法　将C57BL/6小鼠（6～8周龄）随机分为4组,其中3组作为实验组,另1组作为正常对照组。实验组每只小鼠均经腹部皮肤感染（12 ± 1）条日本血吸虫尾蚴,于感染后3、5周和8周各处死1组小鼠;正常对照组小鼠不感染血吸虫,于实验组小鼠感染当天处死。取各组小鼠肝组织和腹腔渗出细胞,检测肝脏和腹腔巨噬细胞数量及其凋亡动态变化。此外,体外用SEA、PBS及卵清蛋白（ovalbumin,OVA）处理纯化的小鼠腹腔巨噬细胞,流式细胞术检测巨噬细胞凋亡;以实时定量PCR和Western blotting技术检测巨噬细胞中BCL⁃2家族成员mRNA和蛋白表达水平;以流式细胞术和Western blotting技术检测caspase 3活化水平。同时,体外在caspase抑制剂、H2O2或N⁃乙酰⁃L⁃半胱氨酸（NAC）存在时用SEA处理巨噬细胞,以流式细胞术检测巨噬细胞凋亡水平。结果　感染日本血吸虫尾蚴后3、5周和8周,小鼠肝脏[（0.873 ± 0.106）× 106、（2.737 ± 0.460）× 106个和（3.107 ± 0.367） × 106个;F = 81.900,P < 0.01]和腹腔中巨噬细胞总数[（5.282 ± 1.136） × 105、（7.500 ± 1.200） × 105个和（12.800 ± 0.800） × 105个;F = 55.720,P < 0.01]不断增加,且感染小鼠肝脏[（0.092 ± 0.018） × 106、（0.186 ± 0.025） × 106 个和（0.173 ± 0.027）× 106 个;F = 57.780,P < 0.000 1]和腹腔中凋亡的巨噬细胞数量[（0.335 ± 0.022）× 105、（0.771 ± 0.099） × 105个和（1.094 ± 0.051） × 105个;F = 49.460,P < 0.01]亦不断增加。经SEA体外处理的巨噬细胞凋亡比例[（24.330 ± 0.784）%]高于PBS [（18.500 ± 1.077）%]及OVA[（18.900 ± 1.350）%]处理组（P均 < 0.01)。经SEA和PBS处理的巨噬细胞中,Bcl⁃2 [（1.662 ± 0.943） vs. （1.00 ± 0.00）;t = 1.215,P > 0.05]、Bax [（0.711 ± 0.200） vs. （1.00 ± 0.00）;t = 2.507,P > 0.05]、Bak [（1.255 ± 0.049） vs. （1.00 ± 0.00）;t = 0.897,P > 0.05]、BCL⁃2 [（0.068 ± 0.004） vs. （0.070 ± 0.005）;t = 0.699,P > 0.05]、BAX [（0.089 ± 0.005） vs. （0.097 ± 0.003）;t = 2.232, P > 0.05]、BAK [（0.439 ± 0.048） vs. （0.571 ± 0.091） ; t = 2.231,P > 0.05]表达水平差异均无统计学意义。在caspase抑制剂存在时,SEA仍能诱导巨噬细胞凋亡（F = 0.411,P > 0.05）;而在H2O2或NAC存在时,SEA不能诱导巨噬细胞凋亡（F = 11.880、9.897,P均< 0.05）。结论　在日本血吸虫感染过程中,SEA可能通过促进活性氧表达而诱导巨噬细胞凋亡。