骨髓间充质干细胞调控肝星状细胞RhoA、P27的表达

目的:观察体外大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对肝星状细胞(HSCs)RhoA信号因子及其细胞周期调控因子P27表达的影响,探讨MSCs调控HSCs细胞周期G1/S转换机制.方法:贴壁筛选法培养、纯化SD大鼠MSCs,传代至第4代使用;大鼠肝星状细胞(HSC-T6)系及纤维原细胞系冻融后传代使用.应用6孔塑料细胞培养盒,每孔使用半透膜(transwellinsert)建立上下双层细胞共培养体系,常规培养.实验分3组:空白对照组、阴性对照组、MSCs实验组.用WST-8法对HSCs增殖率进行测定:流式细胞仪检测细胞周期:RT-PCR、Western blot检测MSCs与HSCs共培养后HSCs内RhoA,P27 mRNA和蛋白的表达.结果:(1)HSCs与MSCs共培养24 h后,HSCs表现明显增殖抑制(P<0.01),且呈现时间依赖性,MSCs实验组与空白对照组、阴性对照组比较均有显著性差异(均P<0.01).(2)共培养12 h后,MSCs可阻滞HSCs由G0G1期向S期转换,使G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,与空白对照组、阴性对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01),(3)共培养12 h后,MSCs实验组RhoAmRNA表达与空白对照组、阴性对照组比较均有统计学差异(P<0.05,P<0.01),随时间的延长呈递减趋势;共培养后,MSCs实验组P27mRNA表达与空白对照组、阴性对照组比较均无统计学差异.(4)共培养12 h后,MSCs实验组RhoA蛋白表达与空白对照组、阴性对照组比较均有统计学差异(均P<0.01),随时间的延长呈递减趋势:共培养12 h后,MSCs实验组P27蛋白与空白对照组、阴性对照组比较均有统计学差异(均P<0.01),随时间的延长呈递增趋势.(5)相关性分析显示:RhoA与P27mRNA的表达无明显相关(r=0.105);RhoA与P27蛋白的表达呈显著负相关(r=-0.943,P<0.01).结论:MSCs抑制HSCs增殖的机制可能是通过RhoA-P27通路调控HSCs细胞周期改变;RhoA活性的下调可能是引起HSCs内P27蛋白表达增加的原因.     

骨髓间充质干细胞对大鼠急性肝损伤修复的影响

目的: 观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植通过抑制RhoA-ROCK信号转导通路对大鼠急性肝损伤修复过程的影响.方法: 贴壁筛选法培养、纯化♂ S D大鼠BMSCs.将健康♀SD大鼠随机分为3组: 正常对照组(N组,n = 10)、CCl4组(C组,n = 10)及CCl4+BMSCs组(T组,n = 10).N组不予任何处理;T组和C组腹腔注射0.1 mL/100 g 600 mL/LCCl4花生油溶液制造急性肝损伤模型后24 h,分别经鼠尾静脉移植的间充质干细胞和等量PBS.各组于不同时间点留取标本,采用HE染色和血清肝功能酶学指标观察受损肝脏恢复过程;RT-PCR方法检测RhoA mRNA的表达;Western blot检测RhoA蛋白的表达.结果: 与C组相比,T组移植BMSCs后能显著改善CCl4急性损伤大鼠肝功能(1 d,ALT: 89.70±3.09 U/L vs 147.59±6.83 U/L,AST: 263.67±17.05 U/L vs 472.68±19.04 U/L,P＜0.01或0.05;7 d,ALT: 42.38±14.31 U/L vs 92.75±6.70U/L,AST 173.85±16.80 U/L vs 260.41±25.35U/L,均P＜0.05),并迅速修复肝脏结构.N组大鼠肝脏RhoA mRNA和蛋白表达量极低,C组经CCl4损伤后RhoA mRNA和蛋白表达量迅速增加(1.39±0.046 vs 0.57±0.010,1.23±0.020vs 0.35±0.036,均P＜0.01),此后表达量缓慢降低.T组经BMSCs移植后,与C组比较,RhoAmRNA和蛋白表达水平迅速下降.结论: Rho-ROCK信号转导通路参与CCl4导致的急性肝损伤发生、发展和修复全过程.BMSCs可能通过抑制RhoA-ROCK信号转导通路加速受损肝脏修复.     

肝星状细胞凋亡机制研究的进展

肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）是位于肝血窦内皮细胞与肝细胞之问的一种肝非实质细胞,约占正常肝内细胞总数的5％～15％。活化的HSCs合成大量胶原和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）,导致肝内ECM过量积聚,胶原合成过多,最终导致肝纤维化和肝硬化形成。由此可见HSCs是引起肝纤维化的主要细胞,HSCs的激活是肝纤维化的中心环节”。要逆转肝纤维化,     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导肝星状细胞系凋亡

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导大鼠肝星状细胞（HSCs）凋亡及其机制。方法 分离培养MSCs, HSC-T6系及纤维原细胞系冻融后传代使用。用6孔塑料培养板,建立上下双层细胞共培养体系。分3组：⑴空白对照组⑵阴性对照组⑶实验组。以上体系培养观察24、48和72h,于倒置相差显微镜下动态观察HSCs细胞形态;免疫组化法检测HSCs a-SMA表达;WST-8法检测HSCs增殖抑制率;流式细胞仪Annexin-V-FITC/PI双染法和DNA凝胶电泳（DNA Ladder ）检测HSCs细胞凋亡;RT-PCR 、Western blot检测HSCs Caspase-3、Bax基因mRNA和蛋白表达。结果 实验组出现明显的DNA Ladder,24h后HSCs 增殖抑制率、凋亡率和Caspase-3, Bax mRNA和蛋白表达呈时间依赖性,显著高于对照组。（P<0.01）结论 MSCs可在体外抑制HSCs增殖,可能通过旁分泌途径诱导HSCs凋亡,其凋亡发生是通过上调Caspase-3、Bax表达发挥作用,本研究支持MSCs通过抑制HSCs产生抗肝纤维化机制。     

骨髓间充质干细胞共培养对肝星状细胞增殖、凋亡和RohA表达的调控

目的:观察体外大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)共培养对肝星状细胞(HSCs)增殖、凋亡和RohA表达的影响,探讨BMSCs旁分泌HGF在其中的作用机制.方法:贴壁筛选法培养、纯化SD大鼠BMSCs,传代至第4代使用;大鼠肝星状细胞(HSC-T6)系及纤维原细胞系冻融后传代使用.应用6孔塑料细胞培养盒,每孔使用半透膜(transwell insert)建立上下双层细胞共培养体系,常规培养.实验分4组:空白对照组、阴性对照组、BMSCs实验组、预处理实验组(c-met多克隆抗体预处理).用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测HSCs细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞凋亡;RT-PGR、Western blot检测BMSCs与HSCs共培养后HSCs内RohA mRNA和蛋白的表达.酶联免疫吸附法(ELISA)检测BMSCs与HSCs共培养上清液中肝细胞生长因子(HGF)浓度.结果:BMSCs对HSCs增殖具有抑制作用,BMSCs与HSCs共培养后24 h、48 h的增殖抑制率分别为12.21%,35.43%,与空白对照组、实验对照组和C-met抗体预处理组比较有显著性差异(P<0.01).Annexin-V-FITC/PI双染法检测BMSCs与HSCs共培养48 h后HSCs的凋亡率为25.80%,与空白对照组、实验对照组与c-met抗体预处理组比较有显著性差异(P<0.01).BMSCs与HSCs共培养48 h,BMSGs组RohA mRNA的表达抑制明显,且显著低于空白对照组、实验对照组与C-met抗体预处理组,有显著性差异(P<0.01).BMSCs与HSCs共培养48 h RohA蛋白的表达明显抑制,且显著低于空白对照组、实验对照组与C-met抗体预处理组,有显著性差异(P<0.01).ELISA检测BMSCs与HSCs共培养24 h、48 h上清液中HGF浓度分别为250 ng/L与570 ng/L,明显高于单独BMSCs培养和单独HSCs培养,有显著性差异(P<0.01).结论:BMSCs与HSCs共培养能抑制HSCs的增殖,促进凋亡,抑制RohA表达,其机制可能是通过BMSCs旁分泌HGF发挥抑制大鼠HSCs增殖,促进凋亡的作用.     

骨髓间充质干细胞诱导肝纤维化大鼠肝星状细胞凋亡和Caspase-3表达

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导肝纤维化大鼠肝星状细胞(HSCs)凋亡及Caspase-3表达.方法 分离培养大鼠MSCs.将肝纤维化模型SD大鼠60只平均分为A(鼠尾静脉注射等量的生理盐水)、B(鼠尾静脉注射含MSCs细胞悬液)、C(鼠尾静脉注射经肝细胞生长因子诱导14 d后的MSCs细胞悬液)组.鼠尾静脉输注2×105MSCs细胞悬液,于第1、2、3、4周末取肝组织,经HE、Masson染色观察肝纤维化程度,用TUNEL法检测各组HSCs凋亡,免疫组化检测Desmin,RT-PCR和Western Blot检测凋亡因子Caspase-3.结果 B、C两组肝组织学改善明显,肝纤维化程度减轻,HSCs数量明显减少,Desmin、TUNEL染色阳性的细胞均增多,Caspase-3基因mRNA和蛋白表达增强,且呈时间依赖性,与A组比较差异有统计学意义,且C组较B组明显(P＜0.01,P＜0.05).结论 MSCs可在体内诱导HSCs凋亡并上调Caspase-3表达,肝细胞生长因子诱导MSCs抗肝纤维化较单纯MSCs作用更强.