ox-LDL经由LOX-1受体对PPARγ-LXRα-ABCA1通路激活的作用研究

目的探讨氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)经由血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)受体对PPARγ-LXRα-ABCA1通路激活的作用。方法浓度梯度ox-LDL(0~40 mg/L,12 h)刺激J774A.1巨噬细胞,检测LXRα、ABCA1的表达。构建293T细胞LOX-1过表达的PPARγ双荧光素酶报告基因系统,激光共聚焦及Western blot检测LOX-1的分布与表达,双荧光素酶报告基因系统检测PPARγ的转录活化情况。对J774A.1巨噬细胞分别进行LOX-1 siRNA和PPARγsiRNA沉默,ox-LDL(30 mg/L,12 h)孵育后检测LXRα、ABCA1蛋白的表达。结果ox-LDL可显著上调J774A.1细胞LXRα和ABCA1的表达(P0.01,n=3)。LOX-1过表达的PPARγ双荧光素酶报告基因系统检测显示ox-LDL能够通过LOX-1增加PPARγ的转录活性;对J774A.1巨噬细胞分别进行LOX-1siRNA、PPARγsiRNA沉默后发现,LXRα和ABCA1的表达均显著降低(P0.01,n=3)。结论 ox-LDL可通过LOX-1受体激活PPARγ转录活性,从而上调LXRα、ABCA1蛋白表达,完成PPARγ-LXRα-ABCA1信号通路的激活。     

人血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1双顺反子表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的尝试构建人血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)基因双顺反子表达载体并检测其在293T细胞中的表达情况和生物学活性,为深入探讨LOX-1在动脉粥样硬化中的作用和以LOX-1为靶点建立干预机制治疗动脉粥样硬化奠定基础。方法首先根据Primer5.0软件设计引物,采用聚合酶链反应法以LOX-1 c DNA片段为模板扩增LOX-1基因完整编码区,克隆至T载体,经测序成功后亚克隆到双顺反子真核表达载体p IRES2-Ac GFP1-Nuc。利用脂质体转染法将双顺反子重组表达质粒转染至293T细胞,倒置荧光显微镜检测质粒转染情况。采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹法鉴定LOX-1基因在核酸和蛋白水平的表达,采用激光共聚焦检测LOX-1基因在293T细胞膜上的表达,激光共聚焦和流式细胞术检测表达在293T细胞膜上的LOX-1结合氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的生物学活性。结果成功构建p IRES2-LOX-1双顺反子重组表达载体,将其转染293T细胞后,观察到绿色荧光蛋白基因的表达,初步表明LOX-1基因转染至293T细胞。进一步分子水平鉴定结果表明LOX-1基因在293T细胞核酸和蛋白水平均得到表达,激光共聚焦结果证明LOX-1基因在293T细胞膜上表达。最后激光共聚焦和流式细胞术结果证实表达在293T细胞膜上的人LOX-1基因可以结合氧化型低密度脂蛋白。结论成功构建人LOX-1基因双顺反子表达载体,在此基础上证明其在293T细胞膜上得到表达,并且具有结合ox-LDL的生物学活性,为后续体外研究其在动脉粥样硬化中的作用以及以此为靶点建立干预机制奠定了基础。     

β2-糖蛋白I/ox-LDL免疫复合物与抗磷脂综合征血管疾病关系的研究进展

β_2-糖蛋白I(β_2-GPI)是抗磷脂综合征(APS)患者体内的主要自身抗原,其可以同氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)等阴性物质结合形成稳定的β_2-GPI免疫复合物。β_2-GPI免疫复合物以及抗β_2-GPI免疫复合物抗体的免疫机制显著促进抗磷脂综合征患者动脉粥样硬化斑块损伤和血栓形成。本文从β_2-GPI/ox-LDL免疫复合物及其抗β_2-GPI/ox-LDL免疫复合物抗体的形成和病理作用进行综述,并重点介绍β_2-GPI-DⅤ阻断β_2-GPI/ox-LDL复合物形成的机制,为β_2-GPI/ox-LDL免疫复合物引起的动脉粥样硬化等心血管疾病提供可能的药物靶点和治疗思路。     

酸枣仁有效成分斯皮诺素对油酸诱导的HepG2细胞的作用研究

目的 通过油酸(Oleic acid, OA)诱导的HepG2细胞模型探讨酸枣仁有效成分斯皮诺素对非酒精性脂肪肝具有保护作用。方法 采用OA诱导HepG2细胞非酒精性脂肪肝模型,MTT法确定OA的最佳浓度;实验分为对照组、模型组、斯皮诺素低剂量组、中剂量组和高剂量组共五组。通过测量TG数值了解细胞脂质蓄积情况,ROS和MDA含量评价细胞氧化损伤程度;进一步获取总RNA,通过转录组学检测基因表达情况。结果 1mM浓度油酸可诱导HepG2细胞发生脂质蓄积,酸枣仁有效成分斯皮诺素能够改善油酸诱导细胞模型的脂质蓄积,降低TG水平。此外还可降低MDA和ROS含量,其抗氧化作用与PGC有关。结论 酸枣仁有效成分斯皮诺素可通过抑制脂质蓄积和抗氧化途径促进油酸诱导的HepG2细胞脂肪变性的恢复。     

脂肪酸移位酶FAT/CD36与长链脂肪酸的结合机制

目的探讨脂肪酸移位酶FAT/CD36与长链脂肪酸的结合机制。方法 ELISA分析重组蛋白FAT/CD36与不同种类长链脂肪酸结合强弱机制,分子模拟对接进一步验证其结合机制并分析其可能作用位点。结果ELISA证明重组蛋白FAT/CD36与不同种类长链脂肪酸均显示特异性结合,结合值大小为油酸棕榈酸棕榈油酸肉豆蔻酸硬脂酸。分子模拟对接进一步验证FAT/CD36受体蛋白主要与其中的油酸、棕榈酸及棕榈油酸结合,且结合位点位于FAT/CD36受体蛋白胞外结构的Arg183-Lys-Gly-Lys-Arg-Asn-Leu-Ser-Tyr238区域组成的活性口袋。结论 FAT/CD36作为细胞长链脂肪酸转运的主要受体,其可能主要转运油酸、棕榈酸和棕榈油酸这三种脂肪酸。     

FATP5基因沉默抑制油酸诱导的HepG2细胞脂肪化及炎症作用

目的 明确FATP5作为脂肪酸转运蛋白家族成员，其基因沉默对肝脏细胞脂肪化及炎症作用的影响，并初步探究该影响可能的机制。方法 设计合成5条shRNA序列，并借助siCHECK^TM系统筛选得到FATP5有效干扰序列。将有效干扰序列包装成慢病毒后，通过细胞感染和嘌呤霉素筛选获得FATP5基因沉默HepG2细胞株。使用Western blot方法检测FATP5基因沉默的效率。之后，利用检测试剂盒、Western blot、核质分离及报告基因方法分别分析FATP5基因沉默细胞中油酸诱导ROS和MDA生成、TNF-α和IL-6蛋白表达与分泌，以及NF-κB活化的变化情况。结果 基因沉默细胞中FATP5蛋白表达水平下降90%,并且脂质蓄积作用也被显著抑制。此外，FATP5基因沉默可减少油酸诱导的ROS及MDA生成，同时还可降低NF-κB的转录活性，并下调其下游炎症因子TNF-α及IL-6的蛋白表达和分泌。结论FATP5基因沉默可减轻脂肪化肝脏细胞的炎症作用，其机制可能与抑制氧化应激和脂质过氧化作用有关。     

原核表达Lunasin的抗炎生物学活性鉴定及其对J774A.1细胞组织因子表达的影响

目的检测原核表达Lunasin(露那辛)的抗炎生物学活性,为Lunasin今后在生物医药领域的开发奠定基础。方法利用基因工程技术将PCR扩增得到的Lunasin DNA片段定向克隆至表达载体p ET28,酶切及测序鉴定后对其诱导表达,利用镍离子亲和层析法对其进行纯化;Griess法和ELISA法检测小鼠J774A.1细胞培养液中Lunasin对一氧化氮和肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等炎症因子含量的影响;Western blot检测Lunasin对核因子κB(NF-κB)p65磷酸化以及组织因子(TF)表达的影响。结果成功构建了Lunasin的原核表达载体,获得纯度达90%的Lunasin多肽。Lunasin能通过抑制脂多糖(LPS)诱导小鼠J774A.1细胞NF-κB的活化而抑制一氧化氮合成以及下游基因肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的表达。Lunasin对LPS诱导的J774A.1细胞TF的表达也具有显著抑制作用。结论原核表达的Lunasin表现出显著的抗炎生物学活性,明显抑制LPS诱导的J774A.1细胞TF表达,其机制可能是通过抑制NF-κB的活化而实现的。