siRNA沉默PPARα减弱羟喜树碱诱导的人结肠癌细胞凋亡

背景:多药耐药一直是遏制提高结肠癌化疗有效性的瓶颈问题。目的:探讨沉默PPARα能否减弱羟喜树碱诱导的人结肠癌细胞凋亡,从而阐明PPARα在羟喜树碱耐药中的潜在作用。方法:构建针对PPARα基因的siRNA干扰载体,并转染人结肠癌SW1116细胞,经G418筛选出稳定转染的细胞,以RT-PCR和蛋白质印迹法验证干扰效果。经羟喜树碱干预后,以MTT法检测细胞增殖,Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡。以定量RT-PCR检测不同浓度miR-506前体转染SW1116细胞后对PPARα下游调控靶基因mRNA表达的影响。结果:siRNA干扰载体Ⅲ的沉默效果最佳,PPARα mRNA和蛋白表达分别下调了约94.1%±3.4%和70.8%±8.6%。稳定转染siRNA的SW1116细胞的半数抑制浓度(IC_(50))为(332±19)μg/L,亲本SW1116细胞为(152±12)μg/L。在相同浓度羟喜树碱的作用下,亲本SW1116细胞的凋亡率显著高于稳定转染siRNA的SW1116细胞(150μg/L:7.0%±2.5%对2.8%±1.6%;300μg/L:32.4%±7.1%对18.5%±2.7%)。miR-506前体下调HMGCS-2表达,上调FABP-2、CCND1和TGF-β1表达,其中上调CCND1的作用最为明显。结论:成功构建了针对PPARα的siRNA干扰载体;沉默PPARα能增强SW1116细胞对羟喜树碱的抵抗性,可能与下调HMGCS-2表达并上调FABP-2、CCND1和TGF-β1表达有关。     

羟基喜树碱富集结肠肿瘤干细胞样群体的初步研究

背景:肿瘤干细胞是临床上肿瘤耐药的主要机制,识别并靶向肿瘤干细胞为肿瘤治疗的研究带来了新的思路。目的:探讨在体外以化疗药物富集结肠肿瘤干细胞样群体的可行性。方法:应用前期实验中以药物浓度递增诱导法建立的羟基喜树碱(HCPT)耐药人结肠癌细胞株SW1116/HCPT,免疫荧光标记干细胞表面抗原CD133,Hoechst33342/PI双染流式细胞仪检测、分选侧群(SP)细胞,实时PCR检测干细胞相关和多药耐药相关基因表达。结果:亲代细胞株SW1116中CD133阳性群体和SP群体分别仅占2%和1%,耐药细胞株SW1116/HCPT中则高达7%和61%,多药耐药基因MDR1抑制剂维拉帕米可使两组SP群体均下降至接近0水平。SW1116/HCPT细胞SP群体中干细胞相关基因CD133、Nanog和多药耐药相关基因MDR1、MRP1、MRP2、MRP6 mRNA表达水平较非SP群体显著上调(P0.05)。结论:HCPT药物浓度递增诱导法可成功富集结肠肿瘤干细胞样群体,其SP亚群中存在于细胞相关和多药耐药相关基因高表达。     

miR-506在人结肠癌羟基喜树碱多药耐药中的功能研究

目的探讨miR-506在人结肠癌羟基喜树碱多药耐药中的潜在作用。方法首先通过PCR从基因组DNA中克隆出包含miR-506前体的片段,将其连接至miRNA表达载体pMIF-cGFP-Zeo中,测序进行验证。将构建成功的pMIF-miR-506转染至低表达miR-506的亲本细胞SW1116中,加入含G418的选择性培养基进行选择性培养。运用RT-PCR验证稳定转染pMIF-miR-506的SW1116细胞株中的miR-506的表达情况,MTT法检测稳定转染pMIF-miR-506的SW1116细胞株和亲本细胞SW1116对羟基喜树碱的敏感性差异,Annexin V/PI检测各自对羟基喜树碱的凋亡情况。结果测序结果表明hsa-miR-506的前体序列被成功地构建至miRNA表达载体pMIF-cGFP-Zeo中。TaqMan荧光定量PCR技术检测发现,相比亲本细胞SW1116,稳定表达绿色荧光的SW1116细胞克隆中miR-506的含量显著升高,约为33.7±8.3倍。细胞增殖试验表明稳定转染pMIF-miR-506的SW1116细胞株的IC50为(280±13)μg/L,而对照组SW1116的IC50为(152±12)μg/L。同时还发现在相同浓度的羟基喜树碱作用下,亲本细胞SW1116较稳定转染pMIF-miR-506的SW1116细胞株的凋亡细胞比率增高(150μg/L:7.8%±1.7%vs5.4%±1.2%;300μg/L:33.6%±3.9%vs18.2%±4.7%)。结论成功地构建了过表达miR-506的载体pMIF-miR-506;过表达miR-506能够增加SW1116对羟基喜树碱的抵抗性。     

microRNA与消化道肿瘤的研究进展

肿瘤的发生是由于一系列癌基因蛋白和抑癌基因蛋白的开放读码框突变所致。microRNA的发现使人们对肿瘤形成有了新的认识，越来越多的证据表明microRNA与肿瘤的发生和发展密切相关。与消化道肿瘤相关的microRNA相继被报道。microRNA的进一步研究将会使消化道肿瘤在发病机制研究、诊断和治疗方面取得重大突破。本文就近年microRNA与消化道肿瘤的研究进展作一综述。     

表皮生长因子受体单克隆抗体在结直肠癌治疗中作用的系统评价

背景：研究表明表皮生长因子受体（EGFR）信号通路可调节细胞的分化、增殖、迁移、凋亡以及血管发生。近年来,靶向EGFR的单克隆抗体拓宽了结直肠癌治疗的选择范围。目的：系统评价EGFR单抗联合结直肠癌治疗方案在结直肠癌治疗中的疗效和安全性。方法：从常用电子数据库中检索结直肠癌治疗方案联合与未联合EGFR单抗治疗结直肠癌的随机对照试验,分析反应率和不良反应发生率的合并比值比（OR）,行亚组分析和敏感性分析,以漏斗图检测出版偏倚。结果：共7项随机对照试验（n=4186）纳入分析。联合与未联合EGFR单抗（治疗组和对照组）的反应率按意向治疗（ITT）分析分别为25．4％和17．6％（OR3．36,95％CI：1．42～7．95）,按方案（PP）分析分别为25．6％和18．0％（OR3．32,95％CI：1．40～7．88）．治疗组反应率明显优于对照组;两组3级以上不良反应总体发生率按ITT分析分别为71．2％和54.3％（OR2．23．95％CI：1．74～2．86）．治疗组3级以上不良反应总体发生率和皮肤损害、腹泻、低镁血症发生率均高于对照组。结论：EGFR单抗可明显提高结直肠癌,尤其是转移性或进展期结直肠癌患者对治疗的反应率,伴3级以上不良反应发生率增高。     

应用芯片技术筛查人结肠癌羟基喜树碱多药耐药相关微RNA的研究

目的 探讨新一类调控分子微RNA(miRNA)在人结肠癌羟基喜树碱多药耐药中的作用,为逆转肿瘤化学治疗的多药耐药性提供新的靶点.方法 运用miRCURYTM LNA Array V8.1版芯片检测人结肠癌细胞SW1116和人结肠癌羟基喜树碱多药耐药细胞SW1116/HCPT的miRNA表达谱,筛选出具有表达差异的miRNA(2倍以上).通过PiTcar,Targetscan,MIRanda等算法在线搜寻差异表达miRNA的靶基因.利用茎环特异miRNA引物反转录特异的miRNA,并采用荧光定量PCR法对个别差异表达的miRNA进行验证.结果 用于芯片分析的总RNA的吸光度比值分别为1.93(SW1116)和1.94(SW1116/HCPT).琼脂糖变性凝胶电泳进一步验证总RNA质量符合芯片要求.通过芯片检测后发现SW1116/HCPT相比SW1116表达下调的miRNA共有28条,表达上调的有36条.根据靶基因预测结果,我们选取其中2条表达下调hsa-miR-452,hsa-miR-373*和1条表达上调hsa-miR-506进行荧光定量PCR验证,hsa-miR-452和hsa-miR-506的结果与芯片相符合,但hsa-miR-373*表达量不足以由荧光定量PCR检测出.结论 miRNA表达量的改变可能在人结肠癌羟基喜树碱多药耐药中起有关键作用.     

炎症性肠病患者肠黏膜炎症和非炎症组织CD27的激活表达

目的比较炎症性肠病患者肠黏膜炎症组织、非炎症组织及正常对照者肠黏膜CD27激活表达的差异,探讨CD27激活表达在炎症性肠病发病中的意义。方法共纳入32例克罗恩病患者、41例溃疡性结肠炎患者及40例正常对照者。分别应用West-ern blot试验和SYBR-green real time PCR方法分析炎症性肠病患者肠黏膜炎症组织、非炎症组织及正常对照者肠黏膜CD27蛋白及其mRNA的表达。数据处理使用GraphPad Prism 5软件。结果克罗恩病和溃疡性结肠炎患者肠黏膜炎症组织CD27蛋白及其mRNA表达均显著高于非炎症组织及正常对照组织(P均0.01);克罗恩病患者肠黏膜非炎症组织CD27蛋白及其mRNA表达显著高于正常对照组织(P=0.000);溃疡性结肠炎患者肠黏膜非炎症组织CD27蛋白表达显著高于正常对照组织(P=0.000)。结论炎症性肠病患者肠黏膜组织中存在CD27的激活表达,这种激活效应不仅出现在内镜表现为炎症性肠病的炎症组织中,甚至出现在炎症性肠病患者内镜表现为正常的肠黏膜中,CD27的激活表达是炎症性肠病发病的早期事件。     

选择性白细胞分离法联合药物治疗对溃疡性结肠炎诱导缓解和维持治疗的荟萃分析

不同研究显示选择性白细胞分离法对溃疡性结肠炎（UC）的疗效差异很大.目的：系统性评价选择性白细胞分离法联合药物治疗对UC诱导缓解和维持治疗的作用.方法：检索PubMed、EMBASE、Cochrane Central Register of Controlled Trials、Science Citation Index和中文科技期刊数据库.纳入所有比较选择性白细胞分离法联合药物治疗与传统药物治疗对UC诱导缓解和维持治疗疗效的随机对照试验（RCTs）.采用RevMan 5.0软件分析两者的诱导缓解率、维持缓解率和不良反应发生率.结果：共9项RCTs、685例患者符合人选标准,7项评估诱导缓解率,2项评估维持缓解率.选择性白细胞分离法联合药物治疗组的诱导缓解率显著高于传统药物治疗组（40.7%对29.1%,OR值为2.19,P〈0.0001）,维持缓解率亦显著高于传统药物治疗组（70.4%对25.0%,OR值为8.14,P=0.002）.选择性白细胞分离法联合药物治疗组的轻中度不良反应发生率明显低于传统药物治疗组（44.7%对65.3%,OR值为0.16,P=0.003）.结论：与传统药物治疗相比,选择性白细胞分离法联合药物治疗能明显提高UC患者的诱导缓解率和维持缓解率,并能降低不良反应发生率.     

表没食子儿茶素没食子酸酯诱导人肝癌细胞HepG2凋亡与TGF-β1-Smad通路激活有关

Objective To investigate the cytotoxic effect of epigallocatechin gallate(EGCG)on human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 cells and corresponding changes of TGF-β1-Smad pathway.Methods The cytotoxic effect of EGCG on HepG2 cells was determined by MTT assay.Cell cycle and apoptosis rate were detected by flow cytometry.RT-PCR and luciferase assay were used to verify whether TGF-β1-Smad signaling pathway is intact in HepG2.The mRNA expression of Smad 2,Smad3,Smad4 and Smad7 was detected by real-time PCR.Results EGCG induced apoptosis in the HepG2 ceils in a time-and concentration-dependent manner.The proportion of G1 phase cells was increased gradually as the concentration increased.However,the percentage of cells in S phase was decreased gradually.Annexin V/PI assay demonstrated that early apoptosis increased as the concentration increased,and late apoptosis also increased,when treated with high-concentration EGCG.The intact TGF-β1-Smad pathway was verified by luciferase assay and RT-PCR.There was no significant effect of EGCG on mRNA level of Smad 2,Smad 3,and Smad 4 in HepG2 cells,but downregulated mRNA level of Smad 7.Conclusion EGCG can reduce apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 cells.The activation of TGF-β1-Smad signaling pathway may be involved in its cytotoxicity mechanisms.     

Ufd1基因沉默逆转SW1116／HCPT细胞株对羟基喜树碱耐药的研究

泛素融合降解1样蛋白（Ufd1）在蛋白质逆向转运中发挥一定作用。前期研究发现羟基喜树碱（HCPT）耐药人结肠癌细胞株SW1116／HCPTUfd1表达增高。目的：探讨Ufd1基因沉默在逆转SW1116／HCPT细胞株对HCPT耐药性中的作用。方法：干扰组SW1116／HCPT细胞转染Ufd1特异性siRNA以沉默Ufd1基因．对照组转染非特异性siRNA。体外药物敏感性试验检测细胞对HCPT的敏感性,流式细胞术检测细胞周期,比色法测定caspase-3活性,蛋白质印迹法检测p-JNK、p53表达情况和细胞内泛素化蛋白贮留情况。结果：干扰组SW1116／HCPT细胞对HCPT的敏感性显著高于对照组（P〈0．05）。经HCPT作用,干扰组和对照组细胞均出现S期阻滞、caspase-3活性增高和p-JNK、p53、泛素表达增加,干扰组更为明显。结论：以RNA干扰技术沉默Ufd1基因可逆转SW1116／HCPT细胞株对HCPT的耐药性,推测该作用可能与活化JNK信号通路、上调p53表达以及致细胞内泛素化蛋白贮留而破坏细胞内蛋白代谢的协调性有关。