新型重组人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体的制备及活性分析

目的：利用大肠杆菌表达新型人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体ScFv,并验证其活性。方法：采用基因融合获得ScFv基因,构建重组表达质粒pET-22b（＋）-ScFv,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达。结果：Western印迹显示目的蛋白表达正确,表达产物以包涵体形式存在,经Ni-NTA柱纯化和体外复性,获得纯度达90%的ScFv蛋白。ELISA结果显示在PBS及人血清中ScFv的结合稳定性有所提高,流式细胞术证明目的蛋白能靶向结合狂犬病毒,通过中和效价测定实验测得ScFv的中和效价为40 U/mg。结论：成功利用原核表达系统实现了对人源抗GPRV ScFv的表达,并且具有一定的中和活性。     

幽门螺旋杆菌ureB、vacA基因的原核表达产物及其与感染病人血清的免疫反应性

目的 在大肠杆菌中重组表达幽门螺旋杆菌UreB、VacA蛋白,并对目的产物与感染病人血清的反应性进行验证.方法 PCR扩增获得ureB、vacA基因,分子生物学方法将基因片段克隆人pET22b( )表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,表达产物经Ni离子亲和层析进行纯化,纯化产物采用Western Blot方法鉴定其与感染病人血清的免疫反应性.结果 构建的重组大肠杆菌高效表达UreB、VacA蛋白,Ni离子亲和层析后获得90%以上纯度的目的蛋白,与感染病人血清具有良好的免疫反应性.结论 重组UreB、VacA蛋白可作为幽门螺旋杆菌感染检测的候选分子.     

肠出血性大肠杆菌紧密黏附素保护性多肽的表达与免疫原性分析

目的:在基因工程菌中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶ H7紧密黏附素(intimin)保护性片段(Int281)的高效表达,并进行抗原性的初步分析.方法:应用PCR从EHEC O157∶ H7基因组中钓取int281基因,插入pMD18-T克隆载体.克隆质粒测序鉴定后,采用NdeⅠ、NotⅠ限制性核酸内切酶双酶切pMD18-T-int281质粒获得int281基因,连接同样经过双酶切的pET-22b( ).表达质粒测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测相对分子质量和Western 印迹验证免疫学活性后,重组Int281蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA检测鼠血清抗体效价.结果:PCR扩增得到843 bp的目的片段.构建的原核表达质粒pET-22b( )-int281经酶切鉴定及测序与预期序列一致.目的蛋白以包涵体形式表达,表达量约25%.变性复性后经镍柱纯化后纯度达95%以上.免疫印迹检测显示,重组Int281片段可以特异性地识别抗O157∶ H7多抗.免疫小鼠抗体效价达1∶ 106.结论:重组Int281具有良好的免疫原性,为制备相应的抗体及研究其对EHEC O157∶ H7黏附定植的被动保护效果奠定了基础.     

大肠杆菌细菌菌蜕的制备及初步研究

目的:利用温度控制噬菌体PhiX174裂解基因E的表达,制备大肠杆菌细菌菌蜕,鉴定其裂解效率并观察其形态.方法:利用PCR技术扩增分离了噬菌体PhiX174裂解基因E并构建其表达质粒,并将质粒转化大肠杆菌DH5α构建工程菌.工程菌培养温度从28℃突升至42℃,每15 min检测菌液D600值,诱导后4 h收集菌体.体外菌落计数计算裂解效率,并通过电镜观察菌蜕结构.结果:获得273 bp的PhiX174裂解基因E全长基因及表达质粒.菌液D600在温度突升至42℃后30 min开始持续下降,2 h后基本维持不变.4 h后收集菌体测得裂解效率为99.99%.电镜观察菌蜕为具有完整外膜结构的细菌空壳,并且无细胞毒性.结论:本研究成功利用噬菌体PhiX174裂解基因E实现了大肠杆菌细菌菌蜕的制备,为进一步的疫苗及递送系统研究奠定了基础.     

人源抗狂犬病毒二硫键稳定抗体在大肠杆菌中的融合表达

目的在大肠杆菌pMAL-P2x系统中表达anti-rabiesMBP-ScdsFv融合蛋白,酶切获得目的蛋白ScdsFv,进行纯化、鉴定及简单活性分析。方法利用DNA重组技术,将全长的ScdsFv蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-p2x中,重组质粒转化大肠杆菌E.coliER2566,IPTG诱导表达。表达产物经Xa酶切后,经Ni柱、AmyloseResin亲和层析进行纯化,SDS-PAGE和Western blot对其进行鉴定,ELISA检测其结合活性。结果成功地构建了重组质粒pMAL-ScdsFv,经诱导表达、蛋白酶切、亲和纯化后获得目的蛋白。ELISA检测其具有抗原特异结合活性,其热稳定性有显著提高。结论抗狂犬病毒ScdsFv蛋白具有良好的结合活性和生物学活性稳定性,可作为候选分子用于狂犬病的防治研究。     

梭菌属神经毒素的基因鉴定与分型

目的:建立梭菌属神经毒素基因快速鉴定和分型的PCR方法。方法:根据GenBank提供的肉毒毒素及破伤风毒素基因序列,综合应用多种生物学软件与在线分析平台,设计特异性及通用检测引物,对各型梭菌属毒素基因进行PCR扩增,验证扩增反应的特异性、通用性、灵敏度及重复性。结果与结论:设计了针对A,B,E,F型肉毒毒素、破伤风毒素基因轻链毒性活性区的5对特异引物,以及重链跨膜区和结合区的一对通用引物(BonAB-P01/P02,BonB-P01/P02,BonE-P01/P02,BonF-P01/P02,TET-P01/P02,TY-P01/P02)。对各型神经毒素进行特异性扩增并在型间进行交叉实验,检测特异性良好,没有交叉反应;通用扩增结果显示均得到1 100 bp大小的条带。目前此检测方法灵敏度可达到(1~3)×103个菌。该检测方法特异性强,灵敏度高,可以用于梭菌属神经毒素基因的快速筛查与鉴定分型。     

志贺毒素B亚单位及其模拟表位的制备和免疫保护效应

目的:对重组表达的StxB和预测的模拟表位肽进行免疫保护效应评价.方法:用分子生物学方法构建基因工程菌,IPTG诱导表达重组StxB,经复性后进行离子交换层析纯化.同时采用生物信息学手段对StxB的表位相关参数进行分析,预测StxB可能的抗原表位.以纯化的StxB和合成的模拟表位肤免疫小鼠后攻毒,评价StxB及其模拟表住肽的免疫保护效应.结果:表达并制备了90%以上纯度重组StxB;发现p14和p17多肽易形成转角和无规卷曲的柔性区段,可及性、极性和亲水性较强,是可能的抗原表位.免疫保护试验显示,经重组StxB和合成多肽免疫的小鼠发病延迟.症状减轻,存活率显著提高.结论:重组StxB和预测的模拟表住肽具有良好的免疫保护效果.为亚单位疫苗及其作用机制的研究奠定了基础.