大鼠胰岛细胞的分离提纯及移植效果观察

背景:胰岛细胞移植已成为治疗1型和部分2型糖尿病的有效途径,但供体不足的问题限制了其发展。目的:改进胰岛细胞的分离和纯化方法,并观察其移植效果。设计:实验方法改进。单位:中国医科大学实验动物部和细胞生物研究室。材料:实验于2006-01/10在中国医科大学实验动物部和细胞生物研究室完成。供体为普通级封闭群Wistar大鼠,雌雄不限,体质量250～300g;受体为普通级封闭群SD大鼠,雄性,(Frompage2388)体质量180～220g,两种大鼠均购自中国医科大学实验动物部(许可证号:SYXK(LIAO)2003-0013)。方法:①胰岛细胞的分离纯化及胰岛功能评估:取未禁食的Wistar大鼠,麻醉后处死。于胆总管起始处剪一小口,将连着装有胶原酶的注射器的1mm直径的腰麻管顺行插入,将冷的胶原酶溶液(1.5g/L)注入胰管内,使胰腺充分膨胀。切取胰腺,将装有胰腺的离心管水浴消化,水浴期间间断加入1mol/L的NaOH使消化液的pH值保持在7.8±1.0,经Ficoll密度梯度离心法纯化胰岛。应用双硫腙法评估胰岛的纯度,应用丫啶橙/碘丙啶法评估胰岛的存活率,存活率=活细胞总数/(活细胞总数 死细胞总数)×100%。通过胰岛素释放实验检测胰岛活性:胰岛素释放指数=第3小时(高糖环境)的胰岛素含量/第2小时(低糖环境)的胰岛素含量。②胰岛移植效果的观察:受体SD大鼠腹腔内注射链脲霉素,非禁食状态下2次血糖>16.7mmol/L确定为糖尿病大鼠。将糖尿病大鼠按随机数字表法分为两组,即胰岛移植组和糖尿病组,每组8只。胰岛移植组于肾被膜下注射约1000个胰岛,糖尿病组注射相应体积的1640培养液,再随机取8只血糖浓度≤5.5mmol/L的SD大鼠作为正常对照组。术后每天检测大鼠血糖,以非禁食血糖小于11.1mmol/L者视为胰岛移植存活。胰岛移植组大鼠血糖正常3d后对胰岛移植组、糖尿病组和正常对照组大鼠分别进行静脉糖耐量试验,测定0,15,30,60,90及120min血糖。主要观察指标:胰岛的纯度、存活率及活性。结果:纳入受体SD大鼠24只,全部进入结果分析,无脱失。①平均每只大鼠胰腺可获得(1150±141)个胰岛,纯度>95%,存活率>98%,胰岛形态完好。②体外胰岛素释放实验低、高糖组的胰岛素释放量为(70.5±6.9)mIU/L,(321.4±11.6)mIU/L,胰岛素释放指数为4.60±0.52,提示所提取的胰岛β细胞有良好的功能。③胰岛移植组大鼠胰岛移植当天血糖既开始下降,3d后血糖下降至正常,维持正常血糖水平(6±2)d;而糖尿病组大鼠血糖均在16.7mmol/L以上。胰岛移植组静脉葡萄糖耐量试验曲线与正常对照组相似。结论:经原位灌注法分离、Ficoll密度梯度离心纯化的胰岛制备技术可以获得高纯度和活力良好的大鼠胰岛细胞。