急性轮状病毒腹泻小儿单个核细胞Toll样受体的变化

目的研究轮状病毒腹泻小儿单个核细胞Toll样受体的变化。方法收集3岁以下因急性轮状病毒腹泻来复旦大学附属儿科医院就诊的小儿75例,以荧光定量RT-PCR方法检测外周血单个核细胞TLR2,3、4、7、8 mRNA的表达情况。结果起病时间在3d以内的小儿外周血单个核细胞中TLR2、3、4、7、8 mRNA的表达水平都有明显升高,P均<0.05。其中TLR2、3、8 mRNA表达在发病7d和14d时仍高于对照组,P均<0.05。TLR4 mRNA的表达在病情较重的患儿比较轻的患儿高,P<0.05。结论多种TLR参与了轮状病毒引发的宿主免疫应答反应的启动和调节。     

2001至2005年上海部分地区腹泻住院患儿诺若病毒分子临床流行病学研究

目的通过对上海地区腹泻住院患儿进行诺若病毒检测,对其流行株进行基因序列的测定,以了解诺若病毒在上海地区的流行特征,为该病原体所致腹泻的防治提供基础数据和理论依据。方法收集2001至2005年复旦大学附属儿科医院5岁以下腹泻住院患儿的粪便标本。首先进行轮状病毒的检测,在轮状病毒抗原阴性标本中,每隔8个标本按编号顺序行机械随机抽样,建立RT-PCR方法进行诺若病毒的检测。对PCR产物进行双向测序,测序结果通过Clustal W和Mega 4.1软件进行分析。结果研究期间共收集腹泻患儿粪便标本5534份,轮状病毒抗原阴性4084份,机械随机抽得484份用于诺若病毒检测,45/484份(9.3%)检测到诺若病毒。对诺若病毒感染季节分布和患儿年龄特点的分析表明,除4月和7月份未检测到诺若病毒外,其余各月份均检测到诺若病毒,其高发的月份是8至11月。5~6月也呈一个小高峰。77.8%(35/45)的患儿<2岁,其中6~11个月的患儿所占比例最高,达35.6%(16/45),<6个月的婴儿占20%(9/45)。GⅡ-4型是这5年间尤其是2003年之后的主要流行型别,2001至2002年尚存在其他的流行型别GⅡ-3和GⅡ-7...     

2006年至2008年上海市住院腹泻患儿A组轮状病毒的分子流行病学调查

目的 分析上海地区住院腹泻患儿A组轮状病毒(RV)基因型别、流行季节及年龄分布,以了解本地区A组RV的分子流行病学动态变化特征,为婴幼儿腹泻的预防和控制提供理论依据.方法 2006年1月至2008年12月共收集来自复旦大学附属儿科医院5岁以下腹泻患儿的5176份粪便标本.抽取其中RV抗原阳性标本380份,采用套式多重RT-PCR法进行RV的基因分型.结果 2006-2008年RV腹泻主要的流行季节是10-12月份,＜3岁的患儿占全部患儿的96.8％.380份粪标本中,222份为G3型,占58.4％,41份为G9型,占10.8％.3年间G1型、G2型均少见,G混合型以G3和G9型的混合为主.2006年和2008年均以P[8]型的流行为主,分别占64.6％(53/82)和46.8％(58/124).2007年以P[4]型为主,占38.5％(67/174).P[6]和P[9]型所占比例较低,P混合型以P[8]和P[4]型的混合为主.G未分型和P未分型在3年间均呈上升趋势.P[8]G3型(20.5％)是上海地区2006-2008年间最主要的A组RV流行株,其次包括P[4]G3型及P[m]G3型.结论 2006-2008年上海地区A组RV显示了新的分子流行病学变化特征,包括主要流行型别的改变,流行型别更趋于多样化.     

EB病毒感染实验室诊断方法探讨

目的 探讨EB病毒(EBV)感染的实验室诊断方法.方法 设计针对EBV基因组的引物和荧光标记探针,利用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测70例外周血标本.其中17例是确诊EBV感染及传染性单核细胞增多症患儿,27例是临床高度怀疑EBV感染患儿,26例是临床非EBV感染的患儿,并与检测EBV抗体VCA-IgM的酶联免疫吸附试验(ELISA)进行比较.结果 确诊组、疑似组和对照组患儿FQ-PCR检测EBV的阳性率分别为100.00%、81.48%和0.00%.与此对应VCA-IgM的阳性率分别为100.00%、25.93%和0.00%.确诊组EBV DNA的平均拷贝数为1.15×105/ml,疑似组为4.38×104/ml,均明显高于对照组(P＜0.05).结论 与VCA-IgM检测方法相比,FQ-PCR检测到EBV感染的阳性率更高,EBV DNA的定量检测可帮助诊断儿科活动性EBV感染,尤其是可疑患儿的临床诊断.     

呼吸道合胞病毒DNA疫苗的构建和免疫效果的初步观察

目的构建呼吸道合胞病毒（RSV）的DNA疫苗并对其免疫效应进行观察,为RSV的免疫预防提供新思路。方法构建表达RSV-F蛋白的质粒pcD—F,接种BALB／c小鼠后以RSV long株进行攻击,于攻击当日和攻击后第5、14天采用ELISA和ELISPOT方法分别检测小鼠RSV特异性IgG抗体和分泌RSV特异性IFN-γ的淋巴细胞,荧光定量PCR方法检测小鼠肺组织RSV—RNA的含量。肺组织切片行苏木精-伊红染色,观察RSVlong株攻击后肺组织病理改变。结果pcD-F免疫小鼠后,产生RSV特异性IgG抗体（滴度1：60）,RSV攻击后第14天,pcD—F免疫小鼠的特异性IgG抗体水平升至1：250,明显高于对照组（P〈0．05）。RSV攻击后,pcD—F免疫小鼠分泌RSV特异性IFN-γ的淋巴细胞升至99个／1×10^5细胞,明显高于对照组的9个／1×10^5细胞（P〈0．05）。pcD-F免疫小鼠的肺部炎症反应明显轻于对照组,肺部RSV得到有效的清除。结论成功构建的RSVDNA疫苗具有良好的免疫原性。     

荧光恒温扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立与评价

目的利用荧光恒温扩增(SAT)技术建立一种快速可靠的肠道病毒71型(EV71)检测方法。方法通过设计特异性的EV71 RNA扩增引物及优化探针技术,使用M-MLV反转录酶及T7 RNA多聚酶对EV71 RNA进行核酸扩增,同时利用荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪进行实时的荧光信号收集和检测。检测复旦大学附属儿科医院儿童手足口病患儿粪便样本199例,以EV71型核酸检测试剂盒作参比方法,DNA测序为第三方验证方法,对研究数据进行Kappa一致性分析。结果 SAT技术共检测到119例EV71阳性样本,其中21例荧光探针法检测为阴性,经测序证实20例样本仍为阳性。SAT与荧光探针法检测结果的Kappa值为0.789。SAT方法的敏感性100%、特异性98.77%。结论本研究建立的EV71型RNA SAT技术具有敏感性高、特异性强、准确、快速可靠等优点,适用于临床对EV71感染的快速诊断。     

急性轮状病毒性腹泻患儿免疫应答的观察

目的 研究小儿在轮状病毒急性感染期的免疫应答特点。方法 采用EIJSA方法检测血浆和粪便轮状病毒特异性抗体，流式细胞术进行淋巴细胞亚群分析，采用荧光定量RT-PCR方法检测外周血单个核细胞转录因子、细胞因子mRNA的表达。结果 腹泻患儿血浆中轮状病毒特异性聊价gG抗体和大便中轮状病毒特异性IgA抗体及CD19细胞亚群比例，均较对照组有明显的升高。腹泻患儿外周血单个核细胞中IL-12p40 mRNA的表达升高。粪便和血浆中IgA抗体的滴度与患儿腹泻的严重程度有一定关系。结论 急性轮状病毒感染小儿早期出现的免疫应答反应，以特异性抗体显著增加为主要特点，并且抗体产生的水平与疾病的严重程度相关。     

菌痢患儿Toll样受体mRNA表达的变化及与炎性细胞因子的关系

目的探讨Toll样受体（TLR）和细胞因子在细菌性痢疾（以下简称“菌痢”）患儿免疫应答中的作用，为该病的防治提供理论线索。方法研究对象为确诊菌痢的患儿55例，建立荧光定量PCR方法对外周血单个核细胞5种TLR和6种炎性细胞因子的基凶表达进行定量检测。结果与正常对照组比较，发病在3d以内和3d以后的小儿外周血白细胞中TLR2、TLR4mRNA的表达水平均有明显的升高。IL-8mRNA的表达水平在发病的全程比对照组均明显升高，IL-12p40mRNA的表达水平在起病早期有3倍的明显升高。升高的TLR2、TLR4和升高的炎性细胞因子之间呈明显的止相关关系。结论菌痢患儿TLR2和TLR4显著升高，并通过促使细胞因子的产生启动并参与免疫应答。     

呼吸道腺病毒快速检测方法探讨

腺病毒(adenovirus，Adv)是引起婴幼儿下呼吸道感染的较为重要的病原之一，引起的肺炎病情危重，具有较强的传染性，故对其进行早期快速诊断，以便临床尽快地进行治疗和隔离显得尤为重要。     

2008至2011年上海单中心住院腹泻儿童轮状病毒基因型别流行特征

目的 监测并分析上海单中心住院腹泻儿童A组轮状病毒（RV）基因型别的变化特征,为RV性腹泻的防治提供基础数据和理论依据。方法 收集2008年1月至2011年12月入住复旦大学附属儿科医院<5岁的腹泻患儿粪便标本,RV抗原阳性者345份,采用套式多重RT-PCR法进行RV的基因分型。结果 ①G基因型：2008至2010年以G3型为主,检出率分别为49.2%、44.6%和78.0%;G9型的流行呈上升趋势,成为2011年最主要的流行型别（51.1%）;G1型在4年中均有检出（8%~20%）;G2型少见,G4型未检出。G混合型中,以G3+G9型为主,其次为G3+G1型,还检出4例3种G基因型的混合。②P基因型：2008、2010和2011年均以P［8］型为主,检出率分别为55.6%、60.0%和68.1%,2009年以P混合基因型（43.2%）为主;P［4］型在4年均有流行;P［6］、P［9］型少见,仅在混合感染中检出P［10］型。P混合型中,以P［8］+P［4］型为主,其次为P［8］+P［10］型。③P［8］G3型是2008至2011年最主要的RV流行株（24.3%）,其次为P［8］G9型及PmG3型。2011年P［8］G9型跃升为最主要的流行型别（40.5%）。结论 与2001至2007年相比,2008至2011年上海地区A组RV基因型出现了新的流行特点,G1型及G9型的流行呈上升趋势,G3的流行有所下降,各种混合型别多见。对RV基因型保持系统性的连续监测对RV疫苗在上海的应用是必要的。