骨桥蛋白在新生大鼠背部皮肤创伤愈合过程中的表达

目的：检测骨桥蛋白（osteopontin,OPN）在新生大鼠皮肤及创伤愈合过程中的表达,探讨OPN参与皮肤创伤愈合的可能机制。方法：在7d龄SD大鼠背部皮肤做直径为1ClTI的圆形全层皮肤切口,运用免疫组织化学方法检测OPN阳性细胞在皮肤及创伤愈合过程中的分布情况,并分别运用RT—PCR及Westernblot检测OPN在创伤愈合不同时间点（1、3、5及7d）的表达情况。结果：在大鼠正常皮肤,免疫组织化学结果显示OPN阳性细胞分布在毛囊、皮脂腺及汗腺,表皮则无表达;RT—PCR及Westernblot均未检测到OPN在正常皮肤中的表达。从创伤后第1天起,OPN阳性细胞开始集中分布在创伤边缘的真皮部位,且在第3天达到高峰,第、5天表达开始减弱。RT—PCR及Westemblot结果一致．OPN相对表达量在第3天达到高峰。结论：研究结果表明OPN参与了皮肤创伤愈合,尤其在创伤修复的炎症期及细胞外基质沉积期。     

大鼠骨桥蛋白干扰质粒的构建及其干扰效率的鉴定

目的:构建针对大鼠骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因的小干扰RNA(microRNA,miRNA)绿色荧光蛋白表达载体,并转染大鼠原代皮肤成纤维细胞后,通过半定量RT-PCR法对其干扰效率进行鉴定,从而筛选出最佳的干扰序列。方法:体外化学合成大鼠OPN序列特异性pre-miRNA双链(OPNi-1,OPNi-2及OPNi-3)和非特异性对照双链OPNi-3M,并分别将退火后的双链克隆至线性质粒表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR。经测序验证后,脂质体介导转染293T细胞进行真核表达验证,并进一步将4种重组质粒经脂质体介导转染大鼠原代皮肤成纤维细胞,半定量RT-PCR法检测各个重组质粒对OPN的干扰效果。结果:经测序验证并转染293T细胞后证明4种重组质粒均构建成功。进一步转染大鼠原代皮肤成纤维细胞后,半定量RT-PCR结果显示OPNi-1、OPNi-2、OPNi-3和OPNi-3M对OPN抑制率分别为49%、35%、21%和2%,而各组间β-actin表达无显著性差异。结论:成功构建针对大鼠OPN的miRNA真核表达载体,其中OPNi-1对大鼠原代成纤维细胞OPN的表达具有最佳抑制率,而对照组OPNi-3M几乎无干扰效果。