伴放线放线杆菌cdtB基因克隆及其表达蛋白的体外生物学活性检测

目的 体外构建伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa)CdtB蛋白的原核表达载体并诱导其表达,通过变性、复性获得有Ⅰ型脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease Ⅰ,DNase Ⅰ)样活性的重组CdtB蛋白,为进一步研究AaCdtB的功能以及Aa细胞致死性扩张毒素三聚体全毒素在牙周炎发生、发展过程中的分子致病机制奠定基础.方法 以AaATCC29522基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应(PCR)法获得cdtB基因,经双酶切、连接的定向克隆技术构建原核表达载体pET-15b-cdtB.转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导CdtB蛋白表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)及蛋白质印迹法检测并鉴定蛋白表达.纯化的重组CdtB体外与超螺旋质粒(pET-32a)DNA孵育,观察其生物学活性.结果 经测序鉴定,构建的原核表达载体pET-15b-cdtB转染的感受态大肠杆菌携带有cdtB基因,该基因片段与GenBank中已收录的AacdtB基因序列一致性高达99%.SDS-PAGE观察到32 000左右的高表达蛋白条带,蛋白质印迹法发现带有6个组氨酸蛋白标签标记的目的 蛋白CdtB.超螺旋质粒DNA与CdtB体外孵育后发生了解螺旋现象.结论 本项研究成功构建了AaCdtB的原核表达载体并诱导CdtB蛋白的体外表达,获得了具有DNaseⅠ样活性的重组CdtB蛋白.     

PGC-1α-shRNA慢病毒载体对牙髓干细胞分化的影响

目的：构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（peroxisome proliferators activated receptor γ coactivator 1α,PGC-1α）短发夹RNA（short hairp in RNA,shRNA）慢病毒表达载体,体外评价其对牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSC）分化的影响。方法：根据shRNA设计原则,设计合成用于体内干扰PGC-1α编码序列的shRNA,重组入慢病毒载体PLKO.1。将构建正确的PLKO.1/PGC-1α-shRNA感染DSPC,实时荧光定量PCR检测PGC-1α的表达,细胞化学染色和实时荧光定量PCR检测其对DPSC分化的影响。结果：测序证实重组质粒构建成功;体外试验表明,DPSC转染了PGC-1α-shRNA后PGC-1α表达水平降低,干扰效率达81%,而且细胞钙化结节增多,牙本质涎磷蛋白和Ⅰ型胶原的表达明显上调,与对照组相比具有显著性差异（P〈0.05）。结论：慢病毒介导的PGC-1α-shRNA成功在体外抑制了目的基因的表达,并影响牙髓干细胞的分化。     

麦考酚酸对斑马鱼胚胎颅面部发育的影响

目的　研究麦考酚酸对斑马鱼胚胎的颅面部发育毒性。方法：对斑马鱼胚胎进行麦考酚酸加药,观察不同时期麦考酚酸对胚胎造成的颅面部发育畸形。胚胎发育至72小时,软骨染色观察颅面部软骨的发育状况。Q-PCR方法检测次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（IMPDH）基因的表达水平。同时鸟苷酸加药,从表型和基因层面考察鸟苷酸对麦考酚酸造成畸形的挽救情况。结果：麦考酚酸可以造成斑马鱼胚胎严重的颅面部畸形,染色结果显示颅面部软骨发育延迟,形态异常。基因检测发现麦考酚酸能够明显下调impdh1b和impdh2的表达水平。鸟苷酸可以挽救麦考酚酸造成的胚胎畸形。结论：麦考酚酸通过下调IMPDH基因,抑制了IMPDH活性,从而造成了斑马鱼胚胎的颅面部发育畸形。     

miR-223调控人牙周膜成纤维细胞中RANKL表达的功能初探

目的：探讨miR?223对人牙周膜成纤维细胞中核因子?κB受体活化因子配体（ RANKL）的调控作用。方法：构建过表达miR?223的人牙周膜成纤维细胞,Western blot及实时定量RT?PCR检测人牙周膜成纤维细胞内RANKL和骨保护素（ OPG）的表达,计算RANKL／OPG比值的改变。结果：过表达miR?223的人牙周膜成纤维细胞,RANKL的表达明显下调,RANKL／OPG比值下降。结论：miR?223可调控RANKL的表达,破坏RANKL／OPG比例的平衡,改变破骨细胞的微环境,影响破骨细胞分化。     

伴放线放线杆菌细胞致死性扩张毒素的细胞毒性研究

目的:体外诱导表达伴放线放线杆菌(Aqqregatibacter actinomycetemcomitans,Aa)细胞致死性扩张毒素(cytolethal distending toxin,CDT),观察其对中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO cell)和人宫颈癌上皮细胞(HeLa cell)的毒性作用。方法:诱导重组蛋白Aa CdtA、CdtB、CdtC的体外表达,采用镍亲和层析柱法纯化目的蛋白,体外重构Aa CDT全毒素。通过体外酶活性实验检测重组蛋白CdtB的生物学活性,并通过细胞克隆形成实验(Colony-forming experiment)及3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe nyltetrazolium bromide,MTT]比色法进一步观察CDT对CHO细胞和HeLa细胞的毒性作用。结果:由重组蛋白Aa CdtA、CdtB、CdtC体外重构获得的Aa CDT全毒素不仅抑制CHO细胞增殖,导致CHO细胞克隆形成单位(Colony-Forming Unit,CFU)数目减少甚至消失。也可抑制He-La细胞增殖并引起包括细胞体积增大及细胞核增大增多的细胞形态学改变,并且此增殖抑制作用呈浓度依赖性。结论:体外成功构建了具有生物学活性的Aa CDT全毒素,且Aa CDT毒性发挥需要三个亚基CdtA、CdtB、CdtC同时存在并构成三聚体。     

rhIL-1α/rhTGF-β1诱导下大鼠髁突软骨细胞PRG4的表达

目的:观察rhTGF-β1对rhIL-1α作用下大鼠髁突软骨细胞蛋白多糖4(PRG4)表达的影响.方法:酶消化法获取髁突软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定.细胞上清液中加入10 ng/ml的rhIL-1α,48 h后加入10 ng/ml的rhTGF-β1.不同时间点应用RT-PCR检测PRG4 mRNA的表达情况,ELISA法检测PRG4蛋白的分泌变化.结果:加入rhIL-1α 24、48、72 h组的PRG4表达量与对照组均有统计学差异(P<0.05),且逐渐降低.48 h组再加入rh TGF-β1 24h后PRG4表达量与对照组无统计学差异(P>0.05),而48 h后与各组均有统计学差异(P<0.05),且最高.结论:rhTGF-β1可以上调髁突软骨细胞PRG4的表达,且可逆转IL-1α的下调作用.     

中间普氏菌培养上清对牙龈成纤维细胞RANKL／OPG表达的影响

目的：探讨中间普氏菌培养上清对牙龈成纤维细胞核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL）、骨保护素（osteoprotegerin,OPG）表达的影响。方法：将系列浓度的中间普氏菌培养上清作用于牙龈成纤维细胞,显微镜下观察细胞的变化。实时定量 RT-PCR法和 Western blot法分别检测 RANKL、OPG mRNA及蛋白水平的表达,并计算 RANKL/OPG的比值。结果：牙龈成纤维细胞的数量随中间普氏菌培养上清浓度的增加而减少,50μg/mL 时,显微镜下没有活细胞存在。在mRNA水平上和蛋白水平上,RANKL/OPG的比值在12．5μg/mL处理组均高于对照组,差异具有统计学意义（P＜0．01）。结论：中间普氏菌培养上清可诱导人牙龈成纤维细胞表达 RANKL 和 OPG,破坏 RANKL/OPG比例的平衡,影响破骨细胞分化的细胞因子微环境,在破骨细胞分化和牙周炎骨吸收中起着一定的调节作用。     

PGC-1α-shRNA慢病毒载体对牙髓干细胞分化的影响

目的:构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferators activated receptor γ coactivator 1α,PGC-1α)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,体外评价其对牙髓干细胞(dental pulp st...