人骨髓基质干细胞染色体核型与端粒酶活性的检测分析

目的分析人骨髓基质干细胞作为组织工程种子细胞,在长期体外扩增及大规模培养条件下,其染色体核型及端粒酶活性是否发生异常的改变。方法采用常规细胞染色体G显带处理方法及端粒酶活性PCR-ELISA检测法分析3例人骨髓基质干细胞样本。结果人骨髓基质干细胞体外培养至P10代,未发现染色体核型异常改变,相应的端粒酶活性也未出现异常增高。结论人骨髓基质干细胞在体外长期培养扩增的条件下,染色体核型及端粒酶活性未出现异常改变,符合种子细胞安全性的应用要求。     

低温保存的GFP标记脂肪源性干细胞体外构建组织工程骨的研究

目的研究经低温保存的GFP基因转染的犬脂肪源性干细胞（ASCs）在脱钙骨（DBM）支架材料上的生长特性及成骨分化潜能。方法胶原酶消化法分离获取并常规培养犬ASCs,用绿色荧光蛋白（GFP）重组逆转录病毒载体转染第2代ASCs,然后进行低温保存。-196℃液氮保存4周后,37℃复苏,测定细胞存活率。低温保存前后的ASCs接种DBM,用成骨诱导液诱导培养2周。激光共聚焦显微镜观察细胞在DBM上的生长情况,DNA定量（Hoechst33258法）测定细胞的体外增殖活性。通过测定碱性磷酸酶（ALP）活性和骨钙蛋白（OCN）含量,观察低温冻存对细胞在支架材料上成骨能力的影响。结果低温冻存复苏后细胞的存活率〉90%,激光共聚焦显微镜显示细胞在材料上黏附生长良好。体外培养12d时细胞增殖达到平台期,ALP活性与OCN含量则随培养时间延长而不断上升,低温保存前后细胞的检测结果无显著差异（P〉0.05）。结论低温保存对GFP标记的犬ASCs在脱钙骨上的体外生长及成骨能力无显著影响,可以作为组织工程骨的种子细胞。     

低温保存对人骨髓基质干细胞在脱钙骨上体外增殖及成骨能力的影响

目的研究低温保存对人骨髓基质干细胞(BMSCs)在脱钙骨(DBM)上生长特性及成骨能力的影响。方法取3例志愿者骨髓(3～5mL),密度梯度离心、差速贴壁法获得BMSCs。第3代BMSCs在-196℃下保存24h,37℃复苏,测定细胞成活率。低温保存前、后的BMSCs分别用成骨诱导液诱导培养,至90%融合时,收集细胞接种在DBM支架上,并测定细胞在DBM上的粘附率。DiI荧光染料标记BMSCs,例置相差显微镜、荧光显微镜和SEM观察低温保存前、后的BMSCs在DBM上的生长及基质分泌情况,MTT法测定细胞在DBM上的增殖活性。通过测定碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OCN)含量观察细胞在DBM上的成骨能力。结果复苏细胞的存活率为(90．24±0．02)%。低温保存前、后的BMSCs在DBM上的粘附率分别为(97．25±1．17)%和(97．00±1．09)%。倒置相差显微镜及SEM观察显示低温保存前、后的BMSCs在DBM上粘附、生长良好,有大量细胞外基质分泌、沉积。低温保存前、后的BMSCs在DBM上MTT吸光度值和ALP活性的检测结果差异无显著性意义(P＞0．05)；体外培养12d时,MTT吸光度值及ALP活性同时达到峰值。低温保存前、后的BMSCs在DBM上分泌OCN的量差异无显著性意义(P＞0．05),OCN含量随着培养时间延长而不断上升,在观察期(16d)内未出现平台期。结论低温保存对人BMSCs在DBM上的体外增殖、粘附及成骨能力影响差异无显著性意义,低温保存的人BMSCs可作为组织工程骨的种子细胞。     

人脐血间充质干细胞修复颅骨缺损的实验研究

目的 应用人脐血间充质干细胞(umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)复合脱钙骨材料构建组织工程化骨,修复裸大鼠颅骨标准缺损.方法 体外扩增培养、成骨诱导人UCB-MSCs,采用Alizarin Red染色和钙离子半定量的方法测定细胞成骨分化能力.将第2代细胞接种在脱钙骨支架材料上继续诱导培养,扫描电镜检测细胞在材料上的生长状况.制备裸大鼠双侧颅骨全层标准缺损(直径5 mm),一侧以细胞材料复合物修复作为实验侧(n=8);另一侧以单纯脱钙骨材料修复作为对照侧(n=8).术后6、12周取材,分别通过大体形态观察、显微CT(Micro-CT)、组织学方法检测颅骨缺损的修复效果.结果 UCB-MSCs体外能够诱导分化为成骨细胞,且在脱钙骨支架材料上生长良好.Micro-CT检测显示术后6周实验侧有部分新生骨组织形成,12周时骨缺损修复率达(78.19±6.45)%,脱钙骨材料降解完全;对照侧6周时无明显新骨生成,12周时材料完全降解,骨缺损未修复.组织学检测显示12周时实验侧有较多成熟骨生成,为骨性愈合;对照侧骨缺损为纤维愈合.结论 成骨诱导的人UCB.MSCs复合脱钙骨材料构建的组织工程化骨可修复裸大鼠颅骨全层标准缺损,有望成为新的组织工程骨种子细胞来源.     

纳米磁铁颗粒标记人骨髓基质干细胞的初步研究

目的 研究纳米磁性氧化铁颗粒与人骨髓基质干细胞(Human bone marrow stromal cells,hBMSCs)共培养对细胞的生长和分化影响,以评价颗粒的生物相容性,并探讨其作为组织工程种子细胞标记物的可行性.方法 制备两种粒径(6 nm和200 nm)的纳米级超顺磁性氧化铁颗粒,分别在细胞接种时及接种后24 h加入.检测纳米磁铁颗粒和骨髓基质干细胞共培养时细胞的增殖能力和成骨分化能力.结果 纳米磁铁颗粒的种类及加入方式对细胞增殖能力没有明显影响.hBMSCs和6 nm粒径的铁颗粒共培养时能保持较好的ALP活性表达,而200 nm粒径的铁颗粒显著降低了hBMSCs的ALP活性.结论 6 nm粒径的磁性氧化铁颗粒和hBMSCs共培养时,对细胞的增殖和成骨诱导能力没有影响,表明其具有良好的生物相容性,有望成为组织工程种子细胞的标记物来进行磁共振成像(MRI)示踪.     

人骨髓基质干细胞成骨诱导后端粒酶活性的检测分析

目的 分析人骨髓基质干细胞作为组织工程种子细胞,在长期体外扩增并进行成骨诱导下,其端粒酶活性是否发生异常的改变.方法 采用端粒酶活性PCR-ELISA检测法分析3例人骨髓基质干细胞成骨诱导样本.结果 人骨髓基质干细胞体外成骨诱导培养至第6代,其端粒酶活性未出现异常增高.结论 人骨髓基质干细胞在体外长期成骨诱导培养扩增的条件下,端粒酶活性未出现异常改变.     

茜素红半定量测定细胞基质钙含量的实验研究

目的使用茜素红检测的方法，对细胞在成骨诱导和未诱导状态下，细胞基质中钙盐沉积情况进行半定量分析，研究细胞基质中钙盐沉积情况变化趋势规律，为临床实践提供理论参考。方法对4例正常人骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）及4例正常人脂肪间充质干细胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells，ASCs），使用茜素红半定量法检测成骨诱导及未诱导细胞基质中钙盐沉积情况进行半定量分析，研究细胞基质中钙盐沉积情况变化趋势规律。结果对于相同代次的间充质干细胞，未诱导组的钙盐沉积情况，在7d后没有显著的改变：而诱导组钙盐的沉积在10～14d明显增多。实验结果同时显示，同一样本的间充质干细胞，随着代次增加，未诱导组钙盐的沉积时间延后，且沉积量逐渐减少。诱导组钙盐的沉积情况，7d时没有显著的改变；14d时，随代次增加，钙盐沉积量逐渐减少。结论体外成骨诱导的第3～4代的间充质干细胞在第10～14天已经具有较强的成骨活性，可能比较适宜体内回植。本实验为组织T程骨的体外构建时间提供了理论依据。     

组织工程骨修复9例颅骨缺损畸形初步报道

目的：探讨利用自体骨髓间充质干细胞（BMSC）作为种子细胞的组织工程骨修复外伤后颅骨缺损畸形的可行性。方法：运用自体BMSC组织工程骨技术,对9例外伤术后颅骨缺损患者行颅骨修复手术。抽取患者自体骨髓,密度梯度离心法分离BMSC,经体外扩增和成骨诱导后,接种部分脱钙骨支架材料,构建组织工程骨。细胞材料复合物体外共培养1周后,手术植入颅骨缺损区。分别于术后1周和3、6、12个月进行临床外形和三维CT检查,随访治疗效果。结果：术后1周三维CT显示,颅骨缺损区被所植入的组织工程骨填充,头颅外形明显改善。术后3至12个月CT显示,组织工程骨形成并修复颅骨缺损,新生骨与骨缺损断端融合。9例患者中2例术后失访,2例高龄患者及大面积骨缺损患者发生不同程度的组织工程骨吸收现象,其余均良好地修复了颅骨缺损。结论：通过选择适宜的病例,以自体BMSC作为种子细胞,运用组织工程技术可以在人体内形成稳定的组织工程化骨并修复颅骨缺损。     

替米沙坦对高血压大鼠血管ACE2表达及氧化应激水平的影响

目的探讨替米沙坦干预对自发性高血压大鼠(SHR)血管组织血管紧张素转换酶2(ACE2)基因表达、一氧化氮(NO)及氧化应激水平的影响。方法选取10周龄SHR及其同源对照WKY大鼠,分别给予替米沙坦(5、10 mg.kg-1.d-1)或安慰剂,为期10周。采用Western blot检测治疗后大鼠主动脉组织中ACE2蛋白及内皮型NO合酶(eNOS)磷酸化水平。分别采用硝酸还原酶比色法与硫代巴比妥酸比色法测定大鼠主动脉组织中NO和丙二醛(MDA)含量。结果与WKY对照组相比,SHR大鼠主动脉组织中ACE2蛋白和Ser1177-eNOS磷酸化水平明显降低(ACE2:0.39±0.05vs 1.00±0.06;p-eNOS:0.43±0.06 vs 1.00±0.04;P值均<0.01),伴NO水平下调及MDA含量增加(NO mmol.g-1protein:11.5±2.1 vs 27.8±4.9;MDA nmol.g-1 protein:393.9±17.9 vs 186.3±14.5;P值均<0.01),而经替米沙坦治疗后SHR低、高剂量治疗组大鼠主动脉组织中ACE2蛋白和Ser1177-eNOS磷酸化水平增加(ACE2:0.62±0.06,0.65±0.07 vs 0.39±0.05;p-eNOS:0.68±0.07,0.71±0.06 vs0.43±0.06;P值均<0.05),伴NO水平升高(19.2±3.3,23.9±3.2 vs 11.5±2.1 mmol.g-1protein;P值均<0.05)与MDA含量下调(271.9±16.1,249.2±19.6 vs 393.9±17.9nmol.g-1protein;P值均<0.05)。结论长期替米沙坦治疗通过提升高血压大鼠血管ACE2表达及eNOS磷酸化水平,可促使血管NO生成及氧化应激水平改善,提示替米沙坦对高血压具有一定的血管保护功效。     

绿色荧光蛋白标记的犬脂肪干细胞体外复合珊瑚材料的生长特性

目的研究犬脂肪干细胞(AdiposeDividedStromalCells,ADSCs)作为种子细复合珊瑚材料体外培养的生长特性。方法分离犬ADSCs,成骨诱导并转染绿色荧光蛋白(GFP)后,复合珊瑚材料培养。检测细胞总数,激光共聚焦观察细胞形态。结果ADSCs-珊瑚复合物体外增殖良好。激光共聚焦显示培养2周后细胞呈老化形态。结论GFP转染不影响细胞传代、增殖。细胞-材料复合物体外培养7天后回植较为适宜。