氯霉素乙酰基转移酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的 建立氯霉素乙酰基转移酶（chloramphenicol acetyltransferase,CAT)双抗体夹心ELISA的实验室检测方法。方法 从质粒pBLCAT6经PCR扩增CAT基因序列，插入到原核表达质粒pGEX-2T中，在大肠埃希菌DH5α中诱导表达；以纯化的融合蛋白GST-CAT为抗原免疫实验用兔，得到的CAT抗血清进行生物素标记，并在此基础上利用生物素链和亲和素放大系统建立双抗体夹心ELISA法，构建不同YY1结合位点突变的HPV16LCRCAT报道质粒，体外瞬时转染真核细胞，提取胞质蛋白，以建立的方法进行CAT表达检测。结果 SDS-PAGE显示表达的GST-CAT融合蛋白相对分子质量约为54000；制备的CAT抗血清可有效地识别原核及哺乳动物细胞表达的CAT蛋白；在不同启动子及调节序列的控制下，利用建立的CAT检测技术证明在瞬时转染的细胞中可诱导2-8倍的CAT表达增强。结论 建立的双抗体夹心ELISA方法可敏感地反映上游序列的启动子活性，以及启动子调节序列变化对启动子活性的影响，使CAT作为报道基因的研究更为简单化。     

消斑方联合氨甲环酸对血管型黄褐斑RCM下皮损变化的影响

目的：观察消斑方联合氨甲环酸口服对血管型黄褐斑的临床疗效及其在反射式共聚焦显微镜（Reflectanceconfocal microscopy,RCM）下的影像学变化。方法：将2021年1月-2022年6月笔者医院收治的60例血管型黄褐斑患者（肝肾阴虚证）随机分为两组，对照组（n=30）予以氨甲环酸片口服；治疗组（n=30）在对照组的基础上予以消斑方治疗。12周后进行临床疗效评定及RCM监测其影像学的变化。结果：治疗12周后，两组疗效总体差异有统计学意义，治疗组疗效优于对照组（P<0.05）;RCM监测下，两组患者树突状细胞形态改变，炎症细胞、黑素细胞、血管数量减少，且治疗组改善优于对照组（P<0.05）；随访2个月后，对照组复发率为33.33%高于治疗组复发率为7.14%(P<0.05)。结论：使用消斑方联合氨甲环酸治疗血管型黄褐斑的临床疗效优于单纯口服氨甲环酸，且复发率明显降低。运用RCM能很好地评估其临床疗效。     

14-3-3蛋白多克隆抗体的制备和应用

目的 制备１４－３－３特异性抗体并试用于朊病毒病患者脑脊液标本检测。方法 以原核细胞表达的谷光甘肽－Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）－１４－３－３蛋白为抗原,免疫家兔。用酶联免疫吸附测定法（ＥＬＩＳＡ）及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法检测制备的抗血清效价和特异性。结果 ＥＬＩＳＡ检测显示所制备的抗体与纯化的ＧＳＴ－１４－３－３蛋白反应效价为１：４０９６０００;Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果证实所制备的抗体可有效识别原核细胞表达的及脑组织提取物中存在的１４－３－３蛋白。对例具有较为典型脑电图改变、临床可疑诊断为克罗伊茨费尔特－雅各布病（Ｃｒｅｕｔｓｆｅｌｄｔ－Ｊａｃｏｂ ｄｉｓｅａｓｅ,ＣＪＤ）病人的脑脊液检测发现其１４－３－３蛋白为阳性;另外４例伴有痴呆、昏迷症状病人脑脊液１４－３－３蛋白为阴性,其中３例进行的脑组织活检显示致     

人PrP特异性多肽抗体的鉴定和应用

目的 为了进一步检测制备的人PrP特异性多肽抗体的免疫反应性和特异性。方法 构建人PrPN端缺失原核表达质粒,表达并纯化N端缺失的PrP蛋白;Western blot检测多肽抗体与纯化的各种人全长、N端缺失以及C端缺失PrP蛋白的反应能力;免疫荧光法检测多肽抗体与真核表达的人PrP蛋白反应能力;提取Creutzfeldt-Jakob病（CJD）病人以及Scrapie感染的仓鼠脑组织,Westen blot检测多肽抗体与致病性PrP－res蛋白的反应能力。结果 所制备的PrP多肽抗体能与原核及真核细胞表达的各种不同长度的PrP蛋白反应,同时还能特异性识别Scrapie感染鼠脑组织中和CJD病人脑组织中的PrP－res蛋白。结论 多肽抗体具备良好的免疫反应性和特异性,可以应用于临床CJD病人的检测。     

人牙本质磷蛋白功能片段的真核表达

目的本研究旨在利用分子生物学技术真核表达包含功能区的人DPP片段。方法构建了人DPP蛋白5’端基因片段的杆状病毒表达质粒pFastBacHb—hDPP—N，经BH10BAC转座反应后感染昆虫细胞sf9，进行重组蛋白的表达。结果经2～3代后，重组病毒产生明显的CPE，人DSPP蛋白特异性多克隆抗体Western blot鉴定，结果显示重组病毒感染3代毒sf9细胞的裂解物中在约17KD位置上出现了特异性的反应条带。结论表明杆状病毒系统可表达人DPP基因片段。为进一步通过对人DPP功能片段的研究揭示DPP在牙齿发育和牙髓修复中的作用及其机制奠定基础。     

牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中促凋亡蛋白Bad的表达改变

目的:检测牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中Bad的表达改变,为保护成骨细胞提供依据。方法:8.348U/L牙龈蛋白酶处理成骨细胞0、4、8、16、24、48和72h,或将不同浓度牙龈蛋白酶与成骨细胞作用24h后,蛋白质印迹法检测Bad蛋白表达改变。结果:在一定范围内,牙龈蛋白酶在诱导成骨细胞凋亡中呈时间和剂量依赖性上调Bad的表达,牙龈蛋白酶抑制剂TLCK有效抑制牙龈蛋白酶所诱导的Bad的高表达。结论:牙龈蛋白酶上调Bad的表达,促凋亡蛋白Bad参与了牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡过程。     

神经元蛋白14-3-3βcDNA克隆及在原核细胞中的表达

目的　利用分子克隆技术在原核细胞中研究 14 3 3 β蛋白的表达。 方法　从神经母细胞瘤细胞系中提取细胞总RNA ,RT PCR扩增 14 3 3 βcDNA ,与克隆载体pGEM T连接后测序 ,再次亚克隆至pGEX 2T表达载体 ,转化大肠杆菌DH5α菌株 ,筛选阳性克隆 ,经异丙基硫代 β D 半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果　经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质印迹 (Westernblot)分析 ,表达的融合蛋白相对分子质量为 5 3 0 0 0左右 ,能与 14 3 3 β蛋白特异性多克隆抗体发生免疫结合反应。结论　人 14 3 3 β蛋白可在原核细胞中表达 ,具有良好的免疫反应性 ,为建立克罗伊茨费尔特 雅各布病 (creutzfeld JacobDISEASE ,CJD)的辅助诊断方法及研究 14 3 3 β蛋白在CJD病分子致病机制中的作用打下了基础。     

人牙本质磷蛋白基因全序列的亚克隆及其5''''端序列的克隆和分析

目的:本研究旨在鉴定质粒pBlueBacHis2-DPP上所携带的外源基因序列;建立带有人DPP基因的稳定克隆株;构建人DPP基因5'端序列重组质粒,为表达纯化人DPP蛋白及其5'端序列提供可参考的数据.方法:用限制性内切酶分析并进行DNA序列测定质粒pBlueBacHis2-DPP上所携带的外源基因序列;以质粒pBlueBacHis2-DPP为模板,构建人DPP基因5'端序列重组质粒,并用蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 4.5分析预测人DPP蛋白N端序列.结果和结论:质粒pBlueBacHis2-DPP上所携带的外源基因序列与基因文库上的人DPP基因序列相符合,建立带有人DPP基因的稳定克隆株pBV222-DPP;蛋白序列分析软件包分析预测人DPP蛋白N端序列氨基酸组成特点与人DPP全序列一致,体外即将表达的蛋白可能具有人DPP生物学功能的重组蛋白.     

HPV16 L1/E6-E7基因嵌和DNA疫苗质粒构建及其在CHO细胞表达的初步研究

目的：构建HPV 16 L1－E6、HPV16 L1－E7预防、治疗性DNA疫苗质粒。方法：运用PCR大引物定点诱变法逐个突变E6、E7基因与转化作用有关的位点，PCR产物连接至pGEMT-Easy质粒，测序鉴定突变基因正确后，分别均与L1基因共同连接并至真核表达载体pVAX1，得到真核表达质粒1MpVAX1-L1E6,2MpVAX1-L1E6,1MpVAX1-L1E7,2MpVAX1-L1E7,3MpVAX1-L1E7。运用磷酸钙法将所获得的质粒转染CHO细胞，以HPV－16L1特异性单克隆抗体进行转染细胞中L1蛋白表达的ELISA和免疫组化的检测。结果：ELISA检测显示转染各种L1－E6、L1－E7融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P／N值均＞2．1；免疫组化检测在胞质胞核可见棕黄色点状阳性产物沉积。结论：所构建的L1－E6、L1－E7融合蛋白表达质粒可在体外表达L1蛋白，为今后进行DNA疫苗动物实验和临床试验研究做好准备。     

人S100蛋白的表达及其抗血清的制备和脑脊液中S100含量测定方法的建立

目的：建立定量检测脑脊液（CSF）及血清中S100蛋白的方法，探讨S100蛋白的检测在辅助诊断克－雅病（CJD）中的应用。方法：利用脑cDNA文库，经PCR获得了S100基因并克隆至原核表达载体pGEX-2T上，在大肠埃希菌中表达了谷胱甘肽－S－转移酶（GST）－S100融合蛋白；融合蛋白经亲和纯化后，免疫家兔，制备抗体；抗体经纯化后，用生物素（BNHS）标记，建立了可定量检测S100蛋白的生物素－亲和素系统ELISA方法，并初步用于临床脑脊液的检测中。结果：所表达的GST－S100蛋白相对分子质量约为35000，以其为抗原制备的S100特异性抗血清具有良好的免疫反应性。建立了定量检测脑脊液中S100蛋白的双抗体夹心ELISA方法，对3例“可能性的CJD”患者（14－3－3蛋白阳性）和15例无痴呆症状患者脑脊液进行检测，结果显示，3例CJD患者脑脊液S100含量均超过2．900μg/L,而在无痴呆症状患者组中14例患者脑脊液S100含量都低于0．180μg/L。对正常人和CJD患者血清进行检测，显示S100蛋白含量个体间差异很大。结论：所建立的方法可用于脑脊液中S100蛋白的检测，进一步扩大标本量有助于明确脑脊液中S100蛋白的检测在辅助诊断CJD中的价值。