艾滋病患者马尔尼菲青霉菌优势株酵母相全长cDNA文库的构建和初步分析

Objective To construct a full length cDNA library of the dominant strain of Penicillium marneffei (PM) in yeast phase isolated from AIDS patients in Guangdong province and screen UniGenes as well as full-length genes, so as to establish the foundation for the study of PM's functional genes and pathogenic mechanisms. Methods CloneMiner cDNA construction kit was utilized to extract mRNA of the dominant PM strain isolated from AIDS patients in Guangdong province. The mRNA was reversed into cDNA, then cloned into a pDONR222 vector by BP recombination to obtain an Uncut cDNA library, which was homogenized later to construct a normalized cDNA library with the principal of saturation hybridization for DNA genome. 2000 clones were chosen randomly to make a bi-directional sequencing and analyzed with bioinformatics for screening UniGenes and full-length genes. Results The total clone number of the Uncut cDNA library was 1.16 × 107 cfu/mL, with a recombination rate of 95% and an average insertion element being over 1 kb. The total clone number of the normalized cDNA library was 1.18 × 106 cfu/mL, with a recombination rate of 95% and an average insertion element being over 1 kb as well. 1945 genes which DNA length were longer than 1 kb were obtained by sequencing and merged into 1360 UniG enes, of which 632 genes were full-length ones. Conclusions The full-length cDNA library of the dominant strain of PM from AIDS patients in Guangdong province possesses good quality.Meanwhile, the technical routine presents high efficiency in obtaining full-length genes and establishing a gene expression spectrum, which can contentedly meet the needs of future experiments.     

艾滋病患者马尔尼菲青霉菌优势株酵母相全长cDNA文库的构建和初步分析

目的 构建广东地区艾滋病患者马尔尼菲青霉菌(PM)优势株酵母相全长cDNA文库,筛选UniGene和全长基因,为PM的功能基因组学研究和致病机制的探讨奠定基础.方法 应用CloneMiner cDNA construction kit提取广东地区艾滋病患者PM优势株酵母相mRNA,反转录成cDNA后通过BP重组方法克隆进pDONR222载体制备成Uncut型cDNA文库,然后利用基因组DNA饱和杂交原理,对Uncut型cDNA文库进行均一化处理,构建均一化cDNA文库.针对均一化文库,随机挑取2000个克隆子进行双向测序,并进行生物信息学分析,筛选UniGene和全长基因.结果 Uncut型cDNA文库总克隆数为1.16×107 cfu/mL,重组率95%,平均插入片段长度＞1 kb;均一化文库总克隆数为1.18×106 cfu/mL,重组率95%,平均插入片段长度＞1 kb.测序获得1945条基因片段长度＞1 kb的序列,归并获得1360个UniGene,632个全长基因.结论 所构建的艾滋病患者PM优势株全长cDNA文库质量较好,采用的技术路线获取全长基因建立基因表达谱的效率较高,可以很好满足下一步实验需要.     

拉米夫定耐药的HBV反转录酶区基因突变模式分析

目的分析慢性乙型肝炎（cHB）患者在拉米夫定（LAM）治疗过程中出现耐药的HBV反转录酶区基因的突变模式及临床特征,指导临床用药。方法采用巢式聚合酶链反应（PCR）方法对2009年1月至2011年12月广州市第八人民医院肝病门诊或住院治疗的LAM初治发生耐药的105例CHB患者血清HBV聚合酶基因反转录酶区进行扩增,对PCR产物进行测序,分析LAM耐药时HBV聚合酶基因的不同突变模式及患者临床特征。结果105例患者诊断为LAM耐药,98例患者检测到LAM相关的HBV聚合酶基因突变,总体突变模式共8种,其中95例患者存在YMDD基因突变,占96．9％。rtM204I单点突变患者42例,占43．9％;rtM204V单点突变患者3例,占3．1％,二者比较差异有统计学意义（χ2=21．899,P〈0．05）,提示rtM204位点（YMDD）点突变模式以rtM204I点突变为主。rtM204V以联合rtL180M组合突变的模式为主。LAM耐药时,3种主要突变模式rtM204I、rtL180M＋rtM2041、rtL180M＋rtM204V患者的年龄、性别比例、血清HBVDNA栽量、ALT水平、肝硬化发生率及HBeAg阳性率比较,差异均无统计学意义（P〉0．05）。HBV聚合酶区基因突变患者与伴生化学突破患者的HBVDNA载量明显高于HBV—P-RT区基因未突变和未发生生化学突破的患者,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论YMDD基因突变是LAM耐药后HBV聚合酶基因突变的主要模式,且突变患者的HBVDNA载量明显增高,检查耐药患者基因序列,可指导临床合理用药。     

HIV/AIDS患者合并分枝杆菌感染的实验室诊断

[摘要] 目的 探讨Versa TREKTM快速培养与MPB64检测在HIV/AIDS患者合并分枝杆菌感染实验室诊断中的应用价值。方法 支气管肺泡灌洗液样本直接涂片染色找抗酸杆菌，并接种分枝杆菌专用培养基于Versa TREKTM细菌培养仪进行监测培养。系统报告阳性后取培养液涂片做抗酸染色，抗酸染色阳性时检测培养液中的结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64；并采用气相色谱法进行分枝杆菌菌种鉴定。结果 97例支气管肺泡灌洗液样本直接涂片染色仅检出5例抗酸杆菌；仪器培养得到30例分枝杆菌，其中21例MPB64阳性样本20例经菌种鉴定证实为结核分枝杆菌、1例为结核分枝杆菌与鸟－胞内分枝杆菌重叠感染；9例MPB64阴性样本均被证实为非结核分枝杆菌。结论 应用Versa TREKTM细菌培养仪进行分枝杆菌快速培养、检测培养液中MPB64以确认是否有结核分枝杆菌生长，可及时准确的对疑似合并分枝杆菌感染的HIV/AIDS患者做出实验室诊断，对临床诊疗具有很好的现实意义。     

艾滋病患者马尔尼菲青霉菌rDNA转录间隔区序列分析

目的 了解广东省和广西地区AIDS患者马尔尼菲青霉菌(PM)分离株rDNA转录间隔区(ITS)序列的特征和变异.方法 AIDS患者PM分离株15株,其中12株来源于广东,3株来源于广西.运用真菌核糖体通用引物ITS1和ITS4,对其rDNA ITS进行扩增和测序,测序结果在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索,构建NJ系统树.结果 15株PM分离株rDNAITS序列长度为578 bp,包括18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA、ITS2及28S rRNA,与来源于日本和泰国的PM的rDNA ITS序列一致性高达97％～100％,同源性100％;11株广东来源PM和1株广西来源PM菌株rDNA ITS序列完全相同,1株广东来源PM和2株广西来源PM菌株的rDNA ITS序列存在1个碱基差异；分子进化树显示,PM与毛霉菌、稻根霉菌rDNA ITS序列的遗传距离最远,与支顶孢菌、组织胞浆菌及青霉属其他菌种如嗜松青霉、棘孢青霉的rDNA ITS序列的种间遗传距离较小.结论 广东和广西地区AIDS患者PM分离株的rDNA ITS序列非常保守,可作为靶基因来设计PM的种特异性引物,用于菌种鉴定.     

脱-γ-羧基凝血酶原及甲胎蛋白诊断原发性肝癌的临床价值

目的探讨脱-γ-羧基凝血酶原（DCP）及甲胎蛋白（AFP）诊断原发性肝癌的临床价值。方法选择原发性肝癌患者105例、慢性肝炎患者75例以及肝硬化患者39例为研究对象,分析DCP和AFP检测结果,并与病理金标准进行比较,评价两种方法对原发性肝癌诊断的灵敏度、特异度。结果 DCP诊断原发性肝癌的灵敏度为80.95%,特异度为85.96%,与病理结果金标准的一致性好（Kappa=0.762）;AFP诊断原发性肝癌的灵敏度为88.57%,特异度为91.23%,与病理结果金标准的一致性好（Kappa=0.824）;DCP和AFP联合检测诊断原发性肝癌的灵敏度为91.43%,特异度为96.49%;与病理结果金标准的一致性好（Kappa=0.883）。结论 DCP和AFP联合检测能够显著提高原发性肝癌诊断的灵敏度、特异度以及与病理检测结果的一致性。     

电化学发光免疫分析法在AFP定量检测中的应用

为了解电化学发光免疫分析 (ECLIA)双抗体夹心法定量检测血清甲胎蛋白 (AFP)的临床应用及其优越性 ,参照NCCLS的评价方案对定量检测AFP含量的ECLIA法和放射免疫分析 (RIA)法进行精密度评价、线性评价和回收试验的比较 ,并采用两种方法平行检测 6 5例病人血清标本的AFP含量 ,对其进行相关性分析。结果表明 :两种方法都有较好的重复性 ,但ECLIA法明显优于RIA法 ;ECLIA法和RIA法具有良好的相关性 (r=0 .981 ,P <0 .0 5 ) ;回收率均在 95 %以上 ,ECLIA法明显高于RIA法 (t=4 .6 9,P <0 .0 5 ) ;ECLIA法的线性范围 (>5 0 0 μg/L)较RIA法 (<5 0 0 μg/L)要宽。ECLIA法定量检测AFP的准确性和精确度都明显优于RIA法 ,较RIA法更能满足临床需要     

乳腺红外线扫描受检者的需求状况及对策研究

目的：探讨乳腺红外线扫描受检者的需求状况。方法：通过问卷调查法对140位乳腺红外线扫描者相关心理需求资料进行分析。结果：本组受检者希望女性医务人员进行检查者为91．1％；希望得到乳房自查及乳腺疾病防治与健康保健指导者为100％，其中83．3％的人员希望得到医务人员的健康保健指导。结论：进行女性性征器官的检查者以女性医务人员最适宜；采用多种方式相结合的健康教育，提高女性对乳房自我保健知识的掌握程度，可满足受检者健康教育的需求。     

游离丙型肝炎病毒核心抗原检测的临床价值探讨

目的:探讨游离丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原检测在HCV感染诊断中的价值。方法:采用荧光定量PCR法检测HCV-RNA、ELISA法同步检测抗-HCV和游离HCV核心抗原。结果:191例HCV感染者HCV-RNA的检出率为71·2%(136/191);抗-HCV的检出率为97·4%(186/191);游离HCV核心抗原的检出率为33·0%(63/191)。其中有2例经抗病毒治疗的患者HCV-RNA和抗-HCV检测均阴性,但游离HCV核心抗原检测阳性;另有1例患者抗-HCV阴性,而游离HCV核心抗原阳性,经HCV-RNA证实为HCV感染。27例非HCV感染者HCV-RNA、抗-HCV和游离HCV核心抗原检测结果均为阴性。结论:HCV核心抗原检测作为抗-HCV检验的补充试验对HCV感染的诊断具有重要价值。     

新型甲型H1N1流感的实验室检测特征及分析

目的比较新型甲型H1N1流感、季节性流感及普通上呼吸道感染的实验室检测特征,进一步认识新型甲型H1N1流感的特点并分析产生的可能机制。方法对我院2009年5～7月收治的新型甲型H1N1流感、季节性流感及普通上呼吸道感染病例的入院实验室检测资料进行回顾性分析。结果新型甲型H1N1流感患者入院时平均血钾为（3.43±0.33）mmol/L,低于季节性流感组和普通上呼吸道感染组,甲型H1N1流感中伴有低钾血症（血钾〈3.5mmol/L）者占60.22%,明显高于另外两组,但合并低钾血症者的血钾平均值在三组间并无明显差异;与另两组相比,新型甲型H1N1流感组外周血白细胞、中性粒细胞、CD4＋T细胞计数降低;其他实验室检测指标包括血钠、血钙、血磷、LDH活性、CK活性等在三组间并无统计学差异。结论新型甲型H1N1流感实验室检测特征包括血钾降低、白细胞、中性粒细胞、CD4＋T细胞减少,其中低钾血症是新型甲型H1N1流感的一个显著实验室特征,其发生的具体机制尚待进一步研究。