抗人卵巢癌×抗人CD3×抗CD28VH单链三特异抗体的胞内可溶表达、纯化及体外活性测定

目的　研究抗人卵巢癌 (ovariancarcinoma ,oc)×抗人CD3×抗CD2 8VH 单链三特异抗体(singlechaintrispecificantibody,scTsAb)在大肠杆菌中的可溶表达与纯化及纯化后产物的活性测定 ,从而为其应用于卵巢癌治疗的临床研究打下基础。方法　将已构建的scTsAb表达载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)Star菌株 ,采用低温 (30℃ )、低剂量IPTG(0 .2mmol L)诱导 ,进行胞内可溶表达。根据抗卵巢癌三特异抗体 (ocTsAb)等电点较高 (pI9.0 ) ,而菌体蛋白大多为酸性蛋白的特点 ,利用DEAE弱阴离子交换层析(pH8.0 )进行一步纯化 ,并利用ELISA及FACS的方法检测纯化后抗卵巢癌三特异抗体的活性。结果　(1)SDS PAGE鉴定低温诱导时可溶比例达到 5 6 %。 (2 )绝大多数菌体蛋白被DEAE层析柱吸附 ,而抗卵巢癌三特异抗体在穿透液中流出 ,SDS PAGE检测纯度达到 90 %。 (3)ELISA结果显示纯化后的抗卵巢癌三特异抗体与重组CD2 8纯抗原 ,Jurkat(CD3 )细胞膜提取抗原 ,SKOV3细胞膜提取抗原均有特异性结合。 (4 )FACS结果证明纯化后的抗卵巢癌三特异抗体与Jurkat(CD3 )活细胞、SKOV3活细胞有特异性结合。结论　低温诱导胞内可溶表达的抗人卵巢癌×抗人CD3×抗CD2 8VH 单链三特异抗体经弱阴离子交换层析一步纯化后仍保持原有免疫学活性 ,这     

细胞凋亡信号通路调控与肿瘤辐射敏感性

电离辐射作用于细胞引起各种损伤而导致细胞死亡的主要机制是诱导细胞发生凋亡。高剂量（大于10Gy）的电离辐射会使细胞发生被动的坏死过程，而促发细胞凋亡所需要的辐射剂量远远低于促发细胞坏死所需剂量。在肿瘤放射治疗过程中，降低辐射剂量诱导肿瘤细胞发生凋亡，而使正常细胞受照剂量降低，减小损伤，具有重要的生物学意义。因此临床上利用放疗方法诱导肿瘤细胞凋亡成为众多肿瘤治疗的目标之一。但由于肿瘤细胞可对放射治疗产生耐受，导致疗效下降，提高肿瘤细胞对放疗的敏感性一直是科研人员关注的研究方向。     

12C6+重离子诱导可溶性TRAIL表达增强及其抗肿瘤作用的实验研究

目的构建可被辐射诱导激活的表达载体pEgr-sTRAIL,研究其体外瞬时转染联合不同剂量的^12C^6＋离子辐照对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和增殖活性的影响。方法SOEing PCR法克隆可溶性TRAIL基因,测序正确后连入pcDNA3.1-Egr质粒,构建pEgr-sTRAIL表达载体;采用GeneCompanionTM聚阳离子转染试剂体外瞬时转染人宫颈癌HeLa细胞;接受不同剂量的^12C^6＋照射后,RT-PCR法检测目的基因 mRNA水平的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,克隆形成实验检测细胞增殖存活。结果成功构建了辐射诱导表达载体pEgr-sTRAIL;瞬时转染联合^12C^6＋离子照射可在mRNA水平上诱导sTRAIL表达增强;随照射剂量的增加,转染pEgr-sTRAIL的HeLa细胞凋亡率明显增加,克隆形成率明显下降。结论^12C^6＋离子可诱导重组质粒pEgr-sTRAIL在被转染的HeLa细胞中表达增高,体外基因-^12C^6＋离子联合治疗可诱导肿瘤细胞凋亡明显增多,具有显著的肿瘤抑制作用。     

程为平项针分区及临床应用

摘要：“程氏项针”是程为平教授以传统经络学说、现代神经纤维学说及全息疗法为理论基础，结合多年临床经验总结并创立的项部针刺方法，是程氏头项针法的重要组成部分，运用于临床，效果显著。程为平教授认为项部为头与身体四肢百骸，五脏六腑连接的重要枢机，是上下经络循行的重要路径。项部既是脏腑经络疾病反映的部位，又是“程氏项针”施术部位。“程氏项针”将项部分为三部九区以治疗周身疾病。     

细胞凋亡抑制蛋白:肿瘤治疗的障碍与靶点

细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)主要通过结合并抑制细胞凋亡执行分子caspase蛋白家族而抑制细胞凋亡。肿瘤细胞高表达IAP是其获得抗凋亡特性的原因之一,成为肿瘤传统治疗(放疗,化疗等)的障碍。但特异的在肿瘤细胞内高表达而在正常细胞特别是高分化细胞中低表达或无表达也为肿瘤治疗提供了新靶点。干涉IAP分子在肿瘤细胞内的表达或功能已被作为肿瘤传统治疗方法的辅助治疗方法来研究。     

smac基因的克隆及过表达对宫颈癌HeLa细胞γ射线敏感性的影响

目的 克隆smac（the second mitochondria-derived activator of caspases,smac）基因,构建真核表达载体pcDNA3.1/smac,并转染宫颈癌HeLa细胞,探讨smac基因过表达对宫颈癌HeLa细胞γ射线敏感性的影响.方法 用RT-PCR的方法从HeLa细胞总RNA中克隆smac基因,连入pcDNA3.1载体并测序.将测序正确的pcDNA3.1/smac载体转染HeLa细胞系,利用RT-PCR法及Western blot鉴定HeLa细胞内smac基因的表达.γ射线照射后48 h利用MTT法检测各组细胞生长抑制率.结果 测序结果表明成功的从HeLa细胞总RNA中扩增了全长smac基因.RT-PCR及Western blot结果表明,转染pcDNA3.1/smac的HeLa/smac细胞中,smac基因表达量明显高于未转染的HeLa细胞及转染空载体pcDNA3.1的HeKa/pcDNA3.1细胞的表达量.不同剂量的γ射线照射48 h后,MTT结果表明,γ射线对转染pcDNA3.1/smac的HeLa/smac细胞的生长抑制率（38.85%）显著高于空白组HeLa细胞（17.64%）及转染空载体pcDNA3.1的HeLa/pcDNA3.1细胞（20.32%）.结论 成功地克隆了smac基因,在宫颈癌HeLa细胞中过表达外源smac基因能够提高其对γ射线的敏感性,有望开辟提高宫颈癌放疗敏感性的新途径.     

电离辐射诱导的两种新线粒体DNA缺失的分析鉴定

目的 筛选电离辐射诱导的线粒体DNA(mtDNA)缺失类型,并进行鉴定。方法 用10 Gy ⁶⁰Co γ 射线照射正常人淋巴细胞细胞系,用2对引物的长PCR扩增照射前后样品的mtDNA基因组。发现可能缺失片段后用限制条件的普通PCR进行确认,并对PCR产物进行纯化、克隆、测序和核酸同源性(BLAST)分析。结果 照射前的淋巴细胞系mtDNA样品只扩增出预期全长片段,照射后每对引物还扩增出可能为缺失造成的短片段;进一步限制条件的普通PCR证实了mtDNA缺失的存在。PCR产物经纯化、克隆后测序进行BLAST分析表明两种mtDNA缺失分别为7455 bp (重链nt475～7929)、9225 bp (重链nt7714～369)的mtDNA缺失,均发生在8bp正向重复序列之间。进一步的生物信息学检索得出两种mtDNA缺失为新发现的mtDNA缺失类型。结论 电离辐射诱导出人淋巴细胞mtDNA 7455 bp和9225 bp缺失。     

Smac基因联合12C6+离子照射对膀胱癌EJ细胞的生物效应观察

目的观察smac基因能否提高膀胱癌EJ细胞12C6 离子照射的生物效应。方法实验分为3组:空白对照组、转染空载体组、转染smac基因组。利用免疫组化及流式细胞仪方法检测3组细胞内smac基因表达。转染24h后对3组分别进行0、2和4Gy12C6 离子照射,用克隆形成实验对3个组分别检测细胞的存活分数并利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果免疫组化结果表明转染pcDNA3.1/smac的细胞其smac基因表达量明显高于转染空载体pcDNA3.1的细胞和空白组细胞。流式细胞仪数据显示,smac基因转染细胞smac基因的荧光强度(3080)显著高于转染空载体组(2256)(P<0.05),而后者与空白对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。克隆形成实验结果表明,转染smac基因组细胞12C6 离子照射后的存活分数较转染空载体组细胞显著降低(P<0.05)。流式细胞仪测定结果表明,12C6 离子照射的转染smac基因组的细胞凋亡率明显高于转染空载体组(P<0.05)。结论外源smac基因转染膀胱癌细胞株能显示高表达,并能提高膀胱癌细胞的凋亡率,与12C6 离子照射结合后能显著降低细胞存活分数和进一步增高凋亡率。