小鼠内皮抑制素真核质粒的构建表达及其体外活性

目的构建小鼠内皮抑制素(endostatin)真核表达质粒,进行分泌性表达,研究其体外生物学活性,以进一步用于肿瘤的基因治疗。方法人工合成小鼠Igκ轻链信号肽序列,RT-PCR获得小鼠内皮抑制素编码序列,一起克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,对其进行酶切鉴定和序列分析。重组质粒经脂质体介导转染受体细胞BHK-21,ELISA检测细胞培养上清中内皮抑制素的含量。用此上清作用于经bFGF刺激的ECV304内皮细胞和HepG2肝癌细胞,MTT法检测细胞的增殖。结果经酶切鉴定及DNA测序分析,Igκ信号肽序列及内皮抑制素编码序列成功克隆到目的位点上,其转染细胞上清中可以检测到分泌出的内皮抑制素,含量为(65.5±10.9)ng/106细胞;并且可以抑制ECV304内皮细胞的增殖,抑制率约为29.2%,而对HepG2肝癌细胞增殖没有影响。结论成功构建了小鼠内皮抑制素真核质粒,其分泌性表达产物可以抑制内皮细胞的增殖,具有较好的生物学活性。     

可溶性日本血吸虫成虫抗原及可溶性蚯蚓抗原对小鼠胸腺细胞亚群的影响

血吸虫疫苗的研究与发展是血吸虫病防治的热点［１］。本实验观察了感染日本血吸虫或以可溶性日本血吸虫成虫抗原（ＳＷＡＰ）及可溶性蚯蚓抗原（ＳＥＷＰ）免疫后小鼠胸腺细胞总数、胸腺活性细胞率、ＣＤ＋４细胞百分率、ＣＤ＋８细胞百分率的变化，现予以报道。１　材料与方法１．１　ＳＥＷＰ及ＳＷＡＰ的制备：蚯蚓为参环毛蚓（ｐｈｅｒｅｔｉｍａａｓｐｅｒｉｇｌｌｕｍ），血吸虫成虫取自人工感染兔，其抗原制备具体方法见文献［２］。所得ＳＥＷＰ蛋白含量为０．１９８ｍｇ／ｍｌ，ＳＷＡＰ蛋白含量为０．１９５ｍｇ／ｍｌ。１．２　…     

B7-1/B7-H1相对比例变化对Hsp70-肽复合物抗肿瘤免疫效应的影响

目的：探讨Hsp7肽复合物对B7-1／B7-H1相对比例的影响及真核表达可溶性PD-1(sPD-1)对Hsp70-肽复合物抗肿瘤作用的影响。方法：通过RT-PCR和半定量PCR技术检测Hsp70-肽复合物体外刺激和体内免疫对小鼠脾细胞正调控共刺激分子B7-1和抑制性共刺激分子B7-H1及其受体PD-1表达的影响；体内转染表达sPD-1后，观察Hsp70-肽复合物免疫小鼠的肿瘤生长以及脾淋巴细胞毒性的变化。结果：基因表达检测表明．Hsp70-肽复合物体外刺激的小鼠脾细胞B7-1 mRNA和B7-H1 mRNA的水平随时问而变化，B7-1／B7-H1比值随刺激时间而增高；Hsp70-肽复合物体内免疫小鼠后期脾细胞B7-1表达下降，B7-H1及其受体PD-1表达上调，B7-1／B7-H1比值逆转；体内表达sPD-1可显著增强和延长Hsp70-肽复合物的抑瘤效果；体内表达sPD-1可提高Hsp70-肽复合物免疫的荷瘤小鼠脾细胞的杀伤率。结论：Hsp70-肽复合物的刺激引起共刺激分子B7-1和B7-H1表达的变化，B7-1／B7-H1的比例与激活效应相关，sPD-1通过阻抑B7-H1／PD-1途径、上调B7-1／B7-H1比例，可增强免疫应答，提高Hsp70-肽复合物特异性免疫治疗肿瘤的效应。     

SLC真核表达质粒的剂量-趋化效应及抑瘤效应研究

目的：观察次级淋巴组织趋化因子（SLC）真核表达质粒剂量-趋化效应关系及不同剂量体内应用时对小鼠H22肝癌的治疗作用。方法：构建了小鼠SLC真核表达质粒（pSLC），体外转染检测pSLC在体外的剂量-趋化效应关系，体内不同剂量的pSLC质粒局部注射检测其表达情况及体内的剂量-趋化效应关系，并观察不同剂量的pSLC对小鼠H22肝癌治疗的剂效关系。结果：当剂量在0．5μg以下时，pSLC在体外转染的趋化效应与转染剂量呈正相关，但在0．75μg时明显下降；pSLC体内局部注射时，在所检测的200μg剂量以内，随注射质粒剂量的增加，其表达的mRNA水平逐渐增加，相应地，对淋巴细胞的趋化作用亦逐渐增强，pSLC对肿瘤的抑制作用亦随其剂量的增加而明显增强（P〈0．001）。结论：体内局部转染表达pSLC，能够有效趋化聚集免疫细胞，对肿瘤产生免疫治疗效应。通过提高转染表达效果，可增加SLC趋化作用，增强肿瘤免疫治疗效应。     

重组可溶性PD-1免疫抑制性受体增强抗小鼠H22肝癌的免疫效应

目的:探讨真核表达PD-1的重组可溶性分子(sPD-1)增强肿瘤局部免疫效应的作用机制.方法:采用半定量RT-PCR方法检测PD-1的配体PD-L1和PD-L2在小鼠H22肝癌细胞和癌组织中的表达水平,流式细胞仪检测其在激活T细胞表面的表达;体外细胞杀伤实验检测sPD-1作用于肿瘤细胞或脾细胞对Hsp70-H22抗原肽复合物激活的脾细胞杀伤H22肝癌细胞的影响;体内抑瘤实验评价局部转染表达sPD-1的抗瘤作用.结果:H22肿瘤细胞本身表达PD-L1基因,PD-L1和PD-L2基因在癌组织中的表达高于正常肌肉组织和单纯癌细胞;PD-L1亦表达于激活的T细胞表面;sPD-1可增强抗原特异性激活的淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效应;在肿瘤接种部位肌注转染表达sPD-1可显著抑制H22肿瘤生长.结论:在肿瘤局部表达可溶性受体sPD-1阻抑PD-L/PD-1通路,既可作用于免疫细胞来提高其正向免疫力,同时也可拮抗H22细胞通过PD-L对免疫细胞的抑制作用,可望成为提高肿瘤基因治疗疗效的一种新手段.     

不同剂量IFN-γ体内对小鼠H22肝癌发生发展的作用研究

目的 探讨不同剂量尤其是低剂量的γ干扰素(IFN-γ)体内表达对小鼠H22肝癌发生发展的影响。方法 利用小鼠H22肝癌体内发生和进展的模型，以不同剂量IFN-γ表达质粒(mIFNG)进行长期和短期直接肌肉转染，检测H22肝癌的发生率及生长速率；半定量RT-PCR、ELISA及实时定量PCR检测IFN-γ的表达情况；肌肉转染表达IFN-γ阻断剂，检测其对IFN-γ作用的影响。结果 注射低剂量(10μg)的mIFNG质粒局部持续表达IFN-γ可明显促进小鼠H22肝癌的发生和发展，然而短暂的表达则没有这种促进作用。IFN-γ拮抗剂则可对抗低剂量表达IFN-γ对肿瘤的促进作用。另一方面，注射高剂量(100μg)的mIFNG质粒局部持续表达IFN-γ则能够介导明显的抗肿瘤效应。结论 IFN-γ对小鼠H22肝癌具有双重作用，也可能是联系慢性炎症与肿瘤发生发展之间的一个十分重要的衔接者。     

日本血吸虫成虫抗原合并蚯蚓抗原对小鼠胸腺淋巴细胞及亚群的影响

ＢＡＬＢ／ｃ小鼠经可溶性日本血吸虫成虫抗原（ＳＷＡＰ）或／和可溶性蚯蚓抗原（ＳＥＷＰ）免疫后,观察、计数其胸腺Ｔ细胞总数、活性Ｔ细胞、Ｌ３Ｔ４细胞以及Ｌｙｔ２细胞。结果显示,ＳＷＡＰ免疫组Ｌ３Ｔ４细胞明显增加（Ｐ＜０．０５）;ＳＥＷＰ免疫组４个指标则均无明显变化（Ｐ＞０．０５）;ＳＷＡＰ与ＳＥＷＰ混合制剂免疫组Ｔ细胞总数、活性Ｔ细胞以及Ｌ３Ｔ４细胞均显增加（Ｐ＜０．０５）。相关分析表明：ＣＤ＋４Ｔ细胞（即Ｌ３Ｔ４细胞）在ＳＷＡＰ所诱导的保护性免疫力中可能起重要作用,而ＳＥＷＰ存在细胞免疫以外的其它可能保护性免疫机制,但ＳＥＷＰ与ＳＷＡＰ有明显的协同作用     

日本血吸虫成虫抗原合并蚯蚓抗原对小鼠胸腺淋巴细胞及亚群 …

ＢＡＬＢ／ｃ小鼠经可溶性日本血吸虫成虫抗原或／和可溶性蚯蚓抗原免疫后，观察，计数及其其胸腺Ｔ细胞总数，活性Ｔ细胞，Ｌ３，Ｔ４细胞以及Ｌｙｔ２细胞。结果显示，ＳＷＡＰ免疫组Ｌ３Ｔ４细胞明显增加；ＳＥＷＰ免疫组４个指标则均无明显变化；ＳＷＡＰ与ＳＥＷＰ混合制剂免疫组Ｔ细胞总数，活性Ｔ细胞以及Ｌ３Ｔ４细胞均显增加。     

可溶性BTLA真核表达载体的构建及其抗肿瘤作用

目的初步研究确定体内表达可溶性B、T淋巴细胞衰减因子（BTLA）对肿瘤生长的抑制作用，探索新的肿瘤免疫治疗途径。方法采用RT—PCR及重组DNA技术构建可溶性BTLA真核表达质粒，体外细胞转染检测重组质粒的转录表达，小鼠实体瘤模型研究基因转染抑制肿瘤生长的作用。结果用RT—PCR从小鼠脾细胞中扩增出编码BTLA胞外段cDNA，克隆至真核表达载体pcDNA3．1．获得重组表达质粒pBTLA；体外转染BHK细胞可检测到重组质粒的转录表达；肌肉内注射转染质粒pBTLA可明显抑制H22小鼠肿瘤的生长。结论可溶性BTLA能够抑制肿瘤生长．提示B7x-BTLA途径参与肿瘤免疫耐受．封闭此途径有可能成为肿瘤免疫治疗的新靶点。     

Investigation on the Effects of Soluble Programmed Death-1 （sPD-1）Enhancing Anti-tumor Immune Response

Summary: By using semi-quantitative RT-PCR method, it was found that PD-L1 mRNA but not PD-L2 mRNA was expressed in H22 hepatoma cells and both PD-L1 and PD-L2 mRNAs were expressed in tumor tissues of tumor bearing mice and upregulated as compared with muscle tissues in normal mice and H22 hcpatoma cells. PD-L1 and PD-L2 were also expressed on the surface of the activated T cells. The soluble recombinant sPD-1 expressed from the constructed eukaryotic expression vector could enhance the lysis of tumor cells by lymphocytes stimulated specifically with antigen. The expresssion of sPD-1 by local gcne therapy on the inoculation site of H22 hepatoma cells could inhibit the growth of tumor. The results of this study indicate tbat expression of soluble receptor of negative costimulatory molecules could reduce the inhibitory effect on T cells in tumor microenvironment and enhance the eytotoxicity of T cells on tumor cells. This possibly provides a new method of improving efficacy of tumor gene therapy.