重组SHH腺病毒纤维蛋白 缓释支架对神经干细胞增殖与分化的影响

目的研究包含重组SHH腺病毒纤维蛋白缓释支架对神经干细胞(NSCs)增殖与分化的影响。方法实验分组:FG-SHH组(将NSCs种植于重组SHH腺病毒-支架组)和对照组(controls)[以培养板、重组SHH腺病毒转染组(SHH)、纤维蛋白胶支架组(FG)为对照组];体外分离培养并鉴定NSCs,构建重组SHH腺病毒纤维蛋白缓释支架,用免疫荧光和免疫印迹方法测定转染效率; MMT法检测细胞增殖活力;免疫荧光和免疫印迹法检测上述各组细胞表达神经细胞相关蛋白:β微管蛋白(β-tubulinⅢ)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达状态。结果体外培养的NSCs高表达nestin;转染重组SHH腺病毒后NSCs可稳定表达SHH;FG-SHH支架促NSCs增殖能力较强,并且FG-SHH组β-tubulinⅢ及MBP阳性细胞率和蛋白表达水平均高于对照组(P0.05),FG-SHH组GFAP的阳性细胞率和蛋白表达水平低于对照组(P0.05)。结论重组SHH腺病毒纤维蛋白缓释支架可以促进NSCs的增殖及其向神经元和少突胶质细胞分化,并抑制星形胶质细胞分化。     

TG2基因修饰的鼻粘膜间充质干细胞向神经样细胞分化的研究

目的:研究重组transglutaminase 2(TG2)腺病毒转染对鼻粘膜骨髓间充质干细胞(EMSCs)向神经样细胞分化影响。方法:利用贴壁筛选法分离培养和扩增EMSCs,通过免疫荧光方法分析EMSCs的纯度,采用免疫荧光和免疫印迹方法测定转染效率。实验分组:重组TG2腺病毒转染EMSCs(ad EMSCs)组、重组GFP腺病毒转染EMSCs组(GFP-EMSCs)和空白对照组(control),诱导细胞向神经样细胞分化,倒置显微镜观察分化过程中细胞形态的变化。免疫荧光和免疫印迹方法检测诱导后EMSCs的轴突膜蛋白(GAP-43),微管相关蛋白(MAP2)和髓磷脂碱性蛋白(MBP)的表达情况。向大鼠脊髓内注射ad EMSCs,2周后取脊髓。结果:实验数据表明转染TG2腺病毒的EMSCs可稳定表达TG2。诱导7 d后,ad EMSCs组细胞呈现双极和多极的典型神经样细胞形态,并且GAP-43,MAP2和MBP的表达水平较对照组高。移植入体内2周的ad EMSCs存活良好且部分细胞表达GAP-43。结论:TG2基因修饰有利于EMSCs在体外向神经样细胞分化,并且具有良好的可移植性。     

氯倍他索对大鼠神经干细胞自发分化的影响

目的:研究氯倍他索(Clo)对神经干细胞自发分化的影响,为Clo治疗中枢性神经损伤提供医学理论基础。方法:利用无血清悬浮法分离培养及鉴定大鼠NSCs;选取第三代NSCs,以含10%胎牛血清完全培养基贴壁诱导分化7 d,培养基中各加入同体积二甲基亚砜、2. 5、5μmol/L的Clo;免疫荧光染色和Western Blot方法检测NSCs分化后轴突膜蛋白(GAP-43)、酸性胶质蛋白(GFAP)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)表达情况,进一步探讨Clo的作用机制。结果:分离培养的NSCs高表达Nestin; Clo作用组表达GAP-43和MBP较对照组明显提高(P 0. 05),GFAP表达水平低于对照组(P 0. 05),Clo作用组表达音猬因子(SHH)和锌指蛋白(Gli 1)均高于对照组(P 0.05)。结论:Clo可在体外通过SHH信号通路促进NSCs向神经元细胞和少突胶质细胞分化,与此同时Clo可抑制NSCs向星形胶质细胞分化。     

氯倍他索促进鼻粘膜间充质干细胞成神经样细胞分化

目的:研究氯倍他索(Clo)对鼻粘膜外胚层间充质干细胞(EMSCs)向神经样细胞分化的影响。方法:贴壁筛选法分离培养EMSCs,免疫荧光法鉴定体外扩增的EMSCs;MTT法检测Clo对EMSCs增殖能力的影响;成神经样细胞诱导实验分为Clo组、音猬因子(SHH)组和空白对照组,采用全反式维甲酸(ATRA)诱导各组细胞向神经样细胞分化;倒置显微镜观察细胞形态的变化;免疫荧光和免疫印迹方法检测神经元细胞相关蛋白。结果:体外分离培养的EMSCs高表达间充质干细胞和神经嵴源干细胞标志物Vimentin和Nestin。各组EMSCs成神经样细胞诱导7 d后,Clo组和SHH组EMSCs呈现双极和多极的典型神经样细胞形态并且高表达神经元细胞相关蛋白。Clo组EMSCs表达SHH和SMO的水平明显高于空白对照组,与SHH组比较差异无统计学意义(P0.05);Clo可促进EMSCs分泌内源性脑神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)。结论:Clo可通过激活SHH信号通路和上调内源性神经营养因子水平促进EMSCs向神经样细胞分化。     

SHH基因修饰的大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞向神经样细胞的诱导分化

目的: 探讨音猬因子（sonic hedgehog,SHH）基因转染对大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞（ectomesenchymal stem cell, EMSCs）分化为神经样细胞的影响。方法: 利用组织贴壁法分离、培养和纯化EMSCs,SHH基因重组腺病毒转染EMSCs（SHH-EMSCs）,免疫荧光染色观察转染前后EMSCs的干细胞标志蛋白巢蛋白、波形蛋白和Connexin-43,蛋白质印迹检测SHH蛋白表达。诱导分化实验分为4组：SHH-EMSCs诱导组、SHH-EMSCs正常培养组、EMSCs诱导组、EMSCs正常培养组;倒置相差显微镜观察分化过程中细胞形态变化;免疫荧光染色和蛋白质印迹检测诱导后轴突膜蛋白（GAP-43）、 β-3微管蛋白（TUBB3）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和髓鞘碱性蛋白（MBP）的表达。并将SHH-EMSCs悬液注入大鼠脊髓组织内,观察该细胞在脊髓内存活和分化情况。结果： 免疫荧光染色结果显示,经SHH基因转染后的EMSCs巢蛋白、波形蛋白和Connexin-43阳性率达90%;蛋白质印迹结果显示,SHH蛋白表达明显升高。SHH-EMSCs诱导组培养7 d后,细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经细胞样形态;免疫荧光染色和蛋白质印迹结果表明SHH-EMSCs诱导组GAP-43、TUBB3、MBP和Smoothen的表达水平明显高于其他3组,差异有统计学意义;GFAP在4组细胞中均为弱表达,无显著差异。SHH EMSCs在大鼠脊髓内存活情况良好且表达TUBB3。 结论： SHH基因转染的EMSCs具有更高的向神经样细胞分化效率,并可在脊髓内存活;EMSCs可望成为移植脊修复髓损伤的一种新的种子细胞。     

SHH缓释的脊髓去细胞支架促进大鼠脊髓损伤修复

目的:研究可缓释音猬因子(sonic hedgehog,SHH)的脊髓去细胞支架(acellular spinal cord scaffolds,ASCSs)对大鼠脊髓损伤修复的效果。方法:(1)用物理和化学联合法制备ASCSs,并检测其效果。(2)使用京尼平(genipin,GP)作为交联剂,体外制备缓释SHH的ASCSs(ASCSs-GP-SHH),探究其缓释效果。(3)建立大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)模型,随机分为四组(每组20只):单纯SCI组,ASCSs组,ASCSs-GP组(GP交联的ASCSs),ASCSs-GP-SHH组。术后每周记录BBB评分,评估功能恢复。术后12周取出损伤处脊髓组织,行免疫组化和Western Blot检测损伤处相关蛋白Nestin(巢蛋白),GAP43(生长相关蛋白),MBP(髓磷脂碱性蛋白),NF200(神经丝蛋白),GFAP(胶质纤维酸性蛋白)的表达。结果:(1)物理及化学联法制备ASCSs效果良好;(2)ASCSs-GP-SHH具有良好的缓释SHH的性能;(3)ASCS-GP-SHH组BBB评分从术后到12周较其他组高(P0.05);(4)免疫组化及HE染色结果显示:ASCS-GP-SHH组脊髓横断处有神经元再生。SCI组神经元凋亡明显,纤维瘢痕及空洞大,ASCS-GP组较ASCS组稍好,ASCS组较SCI组稍好;(5)Western Blot结果显示:ASCS-GP-SHH组Nestin,GAP43,MBP,NF200表达高于SCI、ASCS-GP、ASCS组(P0.05),而GFAP低于SCI、ASCS-GP、ASCS组(P0.05)。结论:物理和化学联合制备可以有效的制备ASCSs,ASCSs-GP-SHH缓释效果良好,对大鼠脊髓损伤的修复有明显的促进作用。     

组织型转谷氨酰胺酶2在鼻黏膜间充质干细胞分化过程中的表达

文题释义：组织型转谷氨酰胺酶：可催化蛋白分子内和分子之间的共价键交联。组织型转谷氨酰胺酶主要以3种形式存在,即细胞内型、细胞膜型和分泌型(以microparticles形式分泌)。分泌到细胞之间的组织型转谷氨酰胺酶2的主要功能是将细胞分泌的细胞外基质分子交联成为三维网络,为细胞生长提供微环境。此外,组织型转谷氨酰胺酶2还可将生长因子与细胞外基质交联。 鼻黏膜间充质干细胞：鼻腔黏膜包括呼吸部黏膜和嗅部黏膜,关于嗅黏膜干细胞和嗅鞘细胞修复神经系统损伤的研究较多,而对呼吸部黏膜干细胞的研究相对较少。呼吸部黏膜面积较大,包括中、下鼻甲及相应的鼻道及鼻中隔中下份黏膜,与嗅黏膜相比,呼吸部黏膜的取材量较大,手术操作更方便,损伤很小,尤其是对嗅觉无损伤,因此对呼吸部黏膜干细胞的研究更有应用价值。 背景：外胚层间充质干细胞可在特定的外环境中定向分化为其他类型细胞,分化过程中一些特殊蛋白的表达可能直接影响其命运的方向。 目的：探讨大鼠鼻黏膜间充质干细胞在成骨细胞分化和成神经样细胞分化过程中组织型转谷氨酰胺酶2的表达。 方法：组织贴壁法分离培养并鉴定大鼠鼻黏膜间充质干细胞,分别进行成神经样细胞、成骨细胞诱导分化。在诱导不同时间点,采用免疫荧光检测神经相关蛋白GAP-43、TUBB3和骨相关蛋白OCN、COLⅠ的表达,免疫印迹法检测神经相关蛋白GAP-43、TUBB3,骨相关蛋白OCN、COLⅠ,神经营养因子NT-3、BDNF,细胞外基质FN、LN以及组织型转谷氨酰胺酶2的表达水平。 结果与结论：①成神经诱导3 d,免疫荧光法观察可见神经元细胞特征性蛋白GAP-43和TUBB3呈阳性表达;成骨诱导7 d,免疫荧光法观察可见成骨细胞特征性蛋白COLⅠ和OCN呈阳性表达;②成神经诱导培养3,5,7 d,免疫印迹法检测神经细胞相关蛋白GAP-43、TUBB3和组织型转谷氨酰胺酶2表达水平随诱导时间延长而增高;成骨诱导7,14 d,免疫印迹法检测成骨细胞相关蛋白COLⅠ、OCN以及组织型转谷氨酰胺酶2水平随诱导时间延长而增高;③成神经诱导7 d,免疫印迹法检测神经营养因子NT-3、BDNF和组织型转谷氨酰胺酶2水平高于未诱导对照组;成骨诱导14 d,免疫印迹法检测细胞外基质FN、LN和组织型转谷氨酰胺酶2水平高于未诱导对照组;④结果表明,组织型转谷氨酰胺酶2可能参与和调控鼻黏膜间充质干细胞向神经样细胞和成骨细胞分化过程。 ORCID: 0000-0001-8451-5850(史文涛) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程