荧光定量PCR法在重组逆转录病毒pLXSN-BDNF滴度测定中的应用

目的制备含大鼠脑源性神经营养因子（BDNF）基因的逆转录病毒，建立荧光定量PCR测定滴度的方法。方法扩增BDNF基因，构建重组质粒pLXSN-BDNF，将其转染包装细胞，经G418筛选、病毒浓缩后用荧光定量PCR法和克隆形成法测定滴度。结果经PCR、酶切和测序鉴定，BDNF基因成功插入逆转录病毒载体中，筛选得到稳定的分泌重组病毒细胞系。重组病毒100倍浓缩后经荧光定量PCR法和克隆形成法测定的滴度分别为6．92×10^6拷贝/ml和3．2×10^5CFU/ml，两种方法测得的结果差异有统计学意义（P〈0．05）。结论成功扩增BDNF基因，制备了重组病毒pLX—SN-BDNF，建立了荧光定量PCR检测滴度的方法，为基因治疗青光眼性视神经损伤的实验研究提供重要参考指标。     

两种方法纯化胎鼠脑室管膜下区神经干细胞的结果比较

目的 利用有限稀释法和连续传代法纯化体外培养的神经干细胞(neural stemcells,NSCs),并对2种方法纯化后的细胞纯度及增生能力进行比较.方法 机械分离孕龄14.5 d的胎鼠脑室管膜下区细胞,利用有限稀释法和连续传代法纯化NSCs,通过免疫细胞化学法鉴定纯度(Nestin阳性卒)及分化细胞的类型.将2种方法纯化后的第3代NSCs以相同的密度接种后连续培养6周,每周进行细胞计数,绘制生长曲线.结果 有限稀释法和连续传代法纯化NSCs的Nestin阳性率均高于原代NSCs(31.00%±0.02%),有限稀释法的Nestin阳性率(91.00%±0.03%)高于连续传代法(58.80%±0.02%,P<0.05).有限稀释法纯化NSCs的生长曲线一直处于增生趋势,而连续传代法的细胞前3周是上升趋势,以后趋于平缓(P<0.05).结论 有限稀释法能有效纯化体外培养的NSCs,并保持细胞良好增生能力及多向分化潜能,为基因治疗视神经损伤疾病提供大量种子细胞.     

重组逆转录病毒pLXSN-脑源性神经营养因子在小鼠胚胎细胞中的表达

神经干细胞移植是近年来治疗视神经损伤疾病新的研究方向之一,然而如何能够让干细胞在眼内移植后定向分化为视网膜神经节细胞,一直是个难题.     

不同强度微波辐射对SD大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响

目的观察不同强度微波辐射对视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGcs）凋亡的影响。方法体外培养RGCs，经频率为2450MHz微波辐射1h，按辐射强度分为4组：0mW·cm^-2组、10mW·cm^-2组、30mW·cm^-2组和60mW·cm^-2组。组。倒置显微镜下观察细胞形态。台盼蓝染色检测细胞存活率，Annexin V—PI荧光标记双染色流式细胞术和TUNEL法检测RGCs的凋亡率。结果各组细胞经辐射后形态均有所改变，细胞存活率分别为98．7％、98．4％、87．8％和63．8％，随微波强度增加而下降；而流式细胞术检测的细胞凋亡率的结果表现出强度及时间相关性，TUNEL法检测的细胞凋亡率分别为5．2％、12．2％、18.0％和18.5％，随微波强度增加而增加。结论2450MHz微波可引起RGCs损伤及细胞凋亡，其损伤程度表现出辐射剂量相关性。     

大鼠BDNF基因克隆和重组逆转录病毒pLXSN-BDNF的构建

目的克隆大鼠脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factors,BDNF)基因并构建含BDNF基因片段的真核表达载体pLXSN-BDNF,用于视神经损伤修复的基因治疗。方法利用RT-PCR的方法从大鼠海马组织的总RNA中扩增BDNF基因片段,序列两端分别引入限制性内切酶识别位点EcoR I和Xho I,并将其定向克隆入pMD18-T Si mple载体,测序正确后亚克隆入逆转录病毒载体pLXSN。结果经过PCR、酶切和测序鉴定,所克隆的BDNF基因序列正确,克隆的BDNF基因已经正确插入到逆转录病毒载体pLXSN中。结论成功克隆了BDNF基因并且构建了真核表达载体pLXSN-BDNF,为进一步研究基因治疗视神经损伤疾病奠定基础。     

原花青素对微波诱导视网膜神经节细胞凋亡的拮抗作用

目的： 探讨不同剂量的原花青素(procyanidin，PC)对微波致视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）损伤的拮抗作用。方法: 体外培养RGCs，将细胞随机分为6组，即不同PC剂量(0 μg/L 、2 μg/L、20 μg/L和40 μg/L)4个实验组及维生素C 40 μg/L组和对照组，分别给予频率为2 450 MHz、功率密度为30 mW/cm2的微波连续辐照1 h，对照组不给予辐照。光镜下观察辐照前后细胞形态学的改变，台盼蓝染色检测细胞存活率，应用流式细胞仪和DNA末端标记法(TdT-mediated-dUTP nick end labeling，TUNEL)定量检测细胞早期凋亡。结果: 微波辐照后，细胞即有聚集现象，部分细胞突起消失。辐照后0 h，20 μg/L和40 μg/L PC组较0 μg/L PC组的细胞凋亡率有所降低(P<0.05)；辐照后6 h和12 h，3个PC剂量组较0 μg/L PC组的细胞凋亡率都有降低(P<0.05)；辐照后18 h，只有40 μg/L PC组较0 μg/L PC组的细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。结论: 微波可诱导RGCs细胞凋亡，PC对此损伤具有一定的拮抗作用。     

基因治疗及其在眼科的基础研究

一、基因治疗随着对遗传性疾病致病机理的深入研究,人们自然就想到如果能够使变异基因和异常表达基因变为正常基因和正常表达基因,那么就可从根本上治愈遗传性疾病,这就是基因治疗的基本思想。20世纪80年代初,安德森博士首先阐明了基因治疗的前景及发展方向。之后的几年内大批科学家在动物身上进行了大量的基因转移(gene transfer)和基因标记(gene marking)实验。1990年9月美国政府批准实施世界上第一例基因治疗临床方案,美国国立卫生研究院的Blase R M[1]等人用腺苷酸脱氢酶(ADA),对一名患有重度联合免疫缺陷症(SCID)的4岁女孩进行基因…