基于同轴细胞打印双网络生物墨水优化及类血管支架的打印

文题释义：双网络生物墨水：生物墨水是指可以用于生物3D打印机的材料,具有类似细胞外基质的理化性质,可用于制造与人体器官相似的组织。双网络生物墨水内部具有两种交联网络,能使体外构建的组织具有良好的机械性能,适用于不同的应用场景。 同轴细胞打印：生物3D打印也叫细胞打印,是指操控细胞生物墨水体外构建活性组织的过程。同轴细胞打印是生物3D打印的延伸和发展,通过结合多层同轴针头可以直接快速制备含有内部连通网络的组织工程支架。 背景：细胞体外培养情况下无法在远离营养物质200 μm以上的区域存活,血管网络构建对组织工程领域厚组织和器官再生至关重要,同轴细胞打印为体外构建类血管通道提供了一种新的方式。 目的：优化生物墨水的同轴细胞打印性能,制备具有类血管结构的组织工程支架。 方法：通过间歇式巴氏灭菌制备无菌海藻酸钠溶液,冷冻保存;以脱胶蚕丝为原料制备无菌丝素蛋白冻干粉,密封保存;将丝素蛋白冻干粉加入解冻的海藻酸钠溶液中,再加入人脐静脉内皮细胞,作为生物墨水;将生物3D打印机的外轴连接生物墨水,内轴连接交联剂,同轴打印类血管支架材料,进行光学相干层析成像扫描、扫描电镜观察;拉伸测试海藻酸钠与丝素蛋白/海藻酸钠同轴打印环形试件(不含细胞)的弹性模量。采用冷冻保存7 d的海藻酸钠溶液与人脐静脉内皮细胞制作同轴打印支架,冷冻保存7 d的海藻酸钠溶液、人脐静脉内皮细胞与密封保存6个月的丝素蛋白冻干粉制作同轴打印支架,培养24 h后死活染色观察细胞存活率。设计打印串联与并联结构的类血管支架,培养1,3,7,10,14 d后检测细胞增殖情况。 结果与结论：①光学相干层析成像扫描显示,该混合生物墨水最高打印高度为9层,整体厚度约为4.4 mm;扫描电镜显示,类血管支架的中空纤维丝外壁呈无规则条状卷曲,存在微米级内部连通孔隙结构,中空纤维丝内壁具有更致密的孔隙结构;②丝素蛋白/海藻酸钠同轴打印环形试件的弹性模量大于单纯海藻酸钠同轴打印环形试件(P < 0.05);③采用保存7 d海藻酸钠溶液制作的支架细胞存活率为(86.7±3.4)%,加入丝素蛋白冻干粉支架的细胞存活率为(98.1±1.2)%,说明冷冻保存7 d的海藻酸钠溶液未染菌,丝素蛋白的保质期可达6个月;④并联结构类血管支架培养7,10,14 d的细胞增殖活性高于串联结构的类血管支架(P < 0.05);⑤结果表明,实验制备的类血管支架材料具有良好的生物相容性与机械性能。 ORCID: 0000-0002-5556-6672(张一帆) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程     

基于同轴流技术的肝组织生物3D打印研究

生物三维打印为医疗领域提供全新的技术可能,可广泛应用于制造人工组织和器官。人工组织的功能和尺寸大小受限于组织的血管化,可利用同轴流挤出系统制造封装肝细胞的中空细丝,结合生物3D打印系统,叠层制造含微通道网络的肝组织。首先搭建集成化的同轴流生物3D打印系统,研究材料挤出速率、材料浓度等参数对中空细丝尺寸及出丝速度的影响;然后以肝细胞株C3A为材料,打印含多层管网机构的仿生肝组织;最后,对含微通道的肝组织进行分组培养,利用细胞活死染色法检测第24、48、72 h肝细胞在灌流组和非灌流组中的细胞存活率。实验表明,同轴流3D打印的组织,中空细丝之间有效融合,支架内部的立体微通道网络完整;打印过程对肝细胞损伤较小,中空细丝中的肝细胞存活率达90%以上;灌流组和非灌流组在培养72 h后,细胞存活率有显著的差异,证明对微通道灌流可以促进组织内部的物质交换,提高微通道周围肝细胞的存活率。研究提出打印方法和灌流系统,为人工组织的血管化以及培养方式提供全新的思路。     

基于细胞3D打印技术的肿瘤药物筛选细胞芯片研究

现有的药物筛选评价技术中,动物筛选模型存在种属差异和周期长等缺点,高通量筛选和细胞筛选模型则与体内环境差异大,药物筛选准确率低。细胞3D打印技术为在体外构建仿真的组织器官模型提供了可能,当其与细胞芯片技术结合则为体外构建高效准确的药物筛选模型提供了新的技术空间。本研究构建了含有多个叉指电极（IDEs）阵列的细胞芯片,用细胞3D打印技术在芯片上组装了卵巢癌细胞HO-8910和人肝间充质干细胞HMSC-H组织模型,并通过对组织模型内细胞阻抗变化的检测,反映细胞生长、贴附、增殖、凋亡的过程及药物对细胞活性的影响等,最终基于该模型检测了抗癌药物顺铂和环磷酰胺对肿瘤细胞的杀伤和肝毒性。结果显示：支架微丝直径和孔径约为200～300 μm,肿瘤细胞和肝细胞在三维结构里生长良好;DMEM作为电解液,芯片在10.4 Hz可准确检测到三维结构中细胞增殖引起的阻抗变化,20 h后阻抗升高69.6%;基于该筛选模型,能同步检测到药物的抗肿瘤作用和肝毒性,并筛选出需要肝的二次代谢产物才能产生抗肿瘤性的药物环磷酰胺。     

基于光学相干层析的生物3D打印人工皮肤量化分析

对人工皮肤3D特征的无损定量检测分析,是研究皮肤打印和诱导培养技术须解决的关键问题。利用谱域光学相干层析成像(SD-OCT),对生物3D打印人工皮肤进行无损成像和量化分析。基于光学相干层析成像(OCT)强度信号的自适应峰值检测算法,量化皮肤3D厚度分布和粗糙度变化,通过计算不同位置的皮肤整体厚度及其波动,定量可视化皮肤的空间分辨结构特征。OCT成像人工皮肤的结构特征与切片的苏木精伊红(H&E)染色结果一致,两者实测皮肤整体厚度差异最大为3.59 μm,可验证该方法的可行性和准确性。通过SD-OCT对人工皮肤在培养周期内的持续检测,2D人工皮肤厚度分布检测可以展示皮肤在不同培养时间的厚度增长曲线,而3D空间分辨厚度分布图和表面粗糙图谱能更直观地显示皮肤生长状态。量化统计结果表明,在气液培养过程中,人工皮肤的整体平均厚度不断增长并趋于稳定,皮肤成熟时整体平均厚度为83.91 μm;皮肤表面粗糙度随角质化程度变化先减后增。基于OCT强度信号量化分析的方法能真实有效反映生物3D打印人工皮肤的结构参数变化,可为人工皮肤制备过程中的质量评估提供一种可靠的监测手段。     

利用同轴3D打印技术构建促内皮细胞生长类血管组织工程支架

体外构建血管网络对组织工程领域厚组织与器官再生至关重要。利用同轴3D打印技术,以海藻酸钠/丝素蛋白为生物墨水,可快速制备含人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的类血管组织工程支架。首先通过材料压缩模量和可打印性测试,优化适用于同轴系统的材料浓度;然后通过光学相干层析成像技术,研究打印参数对中空纤维丝形状的影响,优化同轴打印参数;结合模拟灌流实验,对支架内部类血管结构进行表征;最后通过细胞活、死染色和Alamar Blue法,检测支架中HUVECs生长情况。结果表明,经优化的生物墨水及打印参数能顺利制备具有内部联通性完整的类血管组织工程支架;HUVECs在体外培养时存在团聚生长现象,类血管通道的存在有利于维持组织整体活性,一周存活率在97%以上,且相比对照组能够维持较高的增殖速率。研究证明,利用同轴3D打印技术能成功构建促内皮细胞生长的类血管组织工程支架,可为厚组织及器官再生提供新的可能。     

基于细胞3D打印技术的体外肿瘤模型构建研究

细胞在三维环境中的形态、功能、基因表达等生理特性与二维培养存在显著差异,因此构建与体内生长环境相似的三维细胞培养模型对肿瘤研究有极其重要的作用。利用细胞3D打印技术,将人卵巢癌细胞/明胶/海藻酸钠在体外定位装配成三维类肿瘤组织模型。首先利用MTT比色法检测了细胞3D打印过程对卵巢癌细胞存活率的影响,其次利用Alamar Blue法检测了第1、3、5、7 d卵巢癌细胞在二维平面培养和三维结构体中的增殖情况,最后利用q PCR技术比较了卵巢癌细胞在二维和三维培养下p53和bcl-2的表达差异。结果表明:细胞3D打印过程对卵巢癌细胞活性的损伤很小,细胞存活率为95%以上;相比二维平面培养,卵巢癌细胞在三维结构体中起初增殖速度较慢,但在第5 d之后增殖速度加快,而二维培养的细胞由于接触抑制增殖缓慢,出现脱落死亡;第5和第7d二维和三维培养下细胞中p53和bcl-2基因表达有显著性差异(P0.05)。研究证明,构建具有功能性组织结构和体内更相似的三维系统,可为肿瘤研究提供新的模型。     

生物三维打印细胞负载水凝胶类组织的精准优化

生物三维打印技术与水凝胶的完美结合,可为制造复杂结构功能的组织器官提供一种极具吸引力的解决方案。定制打印细胞负载水凝胶类组织的内部结构,可以更好地仿生真实组织器官的三维微环境,对打印后细胞生长、组织形成和功能再生至关重要。但水凝胶理化特性多变,精准打印与设计结构匹配的多孔结构仍然极具挑战。提出基于光学相干层析成像技术(OCT)的生物三维打印细胞负载水凝胶类组织的精准优化方法,通过自制的三维扫频OCT系统无损在线成像打印组织块和定量评价结构参数,迭代降低设计与打印间的结构差异,提高细胞负载水凝胶打印的精准性和稳定性。实验结果表明,基于OCT无损定量表征结果反馈优化打印参数设置,指导打印过程,使得细胞负载水凝胶类组织的结构形态参数与设计值的偏差从40%左右控制到7%以内,包括内部孔隙尺寸、支撑尺寸、孔隙率、表面积、体积五项关键参数;细胞培养两周后的存活率从80%左右显著提高到90%以上。研究表明OCT技术为批量定制细胞负载水凝胶类组织、生物三维打印组织和器官等提供了具有潜力的精准化工具。     

基于3D打印细胞培养支架内部血管通道的模拟与构建

传统的三维支架细胞培养技术已能较好地实现细胞在培养过程中的空间排布,但是其结构仍不具有类血管网络的通道结构,尚不能完全模仿人体内部的细胞生长环境。在3D打印生物支架的基础上,借助强制结构优化方法,利用VS平台上的C++自编译软件,在三维生物支架STL模型内部构建出模拟的三维血管通路,生成新的三维生物支架STL模型,并利用3D生物打印机打印出实物。通过对打印支架的空隙和血管大小的统计分析以及与数字模型的参数对比分析得出,打印出的实物支架孔隙(孔隙间距、线宽)的平均值及打印血管(孔隙间距、线宽)的平均数据与对应数字模型的设定数据的误差均在5%以内,符合设计要求。另外,该研究可增加细胞培养支架内部液体的流通性,使支架结构进一步接近人体内环境,为模拟人体内液体循环对于细胞生长的影响提供可能。     

基于三维打印的磷酸三钙骨组织工程支架烧结工艺研究

磷酸三钙(TCP)是构建骨组织工程支架常用的生物陶瓷材料。三维(3D)打印的TCP支架具有精确可控的孔隙结构,但存在力学性能不足的问题。由于烧结工艺对生物陶瓷支架力学性能的影响至关重要,本文详细探讨了不同烧结温度对3D打印TCP支架的力学性能的影响,测试了不同烧结温度制备的支架的表观形貌、质量和体积收缩率、孔隙率、力学性能以及降解性能。结果表明,当烧结温度为1150℃时,晶粒生长充分、气孔最少,支架具有最大的体积收缩率、最小的孔隙率以及最优的力学性能,压缩模量和抗压强度可以分别达到(100.08±18.6)MPa和(6.52±0.84)MPa,能够满足人体松质骨力学强度的要求。此外,与其他烧结温度下制备的支架相比,1150℃下烧结制备的支架在酸性环境中降解最慢,进一步说明其在长期植入时具有更佳的力学稳定性。该支架可支持骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附和快速增殖,具有良好的生物相容性。综上,本文优化了3D打印TCP支架的烧结工艺,提高了其力学性能,为其作为承重骨的应用奠定了基础。     

凝血因子XⅢ（FXⅢ）活性与α2-纤溶酶抑制物（α2-PI）水平差异关系的探讨

"获得性血友病(AH)"是一种自身免疫性疾病,它是由于抵抗凝血因子的自身抗体的存在而产生的,最常见的凝血因子Ⅷ(FⅧ),不太常见的因子如Ⅸ,Ⅴ,Ⅶ,Ⅺ和极少见的因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)和凝血酶原。关于"由抗FⅩⅢ抑制剂(AH-13)产生的获得性/自身免疫性血友病"的相关信息目前还比较少的被收集和研究[5-6]。但是,最近在中国AH-13也一直在增加,而AH-13必须区别于常规的"获得性出血FⅩⅢ缺乏症(HAFⅩⅢdef)",因为AH-13往往比普通的HAFⅩⅢdef更严重,需要免疫抑制的治疗以消除自身抗体,