miR-580对乳腺癌细胞系中Twist1的调节作用

目的：探讨miR-580在MCF-10A细胞系中对Twist1的调节。方法：本实验利用生物信息学方法预测Twist1的靶miRNA是miR-580。首先,采用qPCR法检测在MCF-10A系列细胞系中Twist1及miR-580的表达。然后,在MCF-10A细胞系中分别转染miR-580类似物和miR-580抑制物后,利用RT-PCR、Western blot、t检验分析Twist1的表达及细胞迁移能力的变化。最后利用荧光素酶实验验证miR-580通过结合在Twist1的3'UTR调节其表达。结果：1)在MCF-10A细胞系中Twist1与miR-580的表达呈负相关;2)在MCF-10A细胞系中转染miR-580类似物后,Twist1的表达下调;在MCF-10A细胞系中转染miR-580抑制物后Twist1的表达上调;3)在MCF-10A细胞系中引入miR-580类似物后细胞迁移能力降低;4)miR-580直接结合在Twist1的3'UTR。结论：miRNA-580在MCF-10A细胞系中通过结合在Twist1的3'UTR负向调节Twist1的表达从而克制细胞的迁移。     

阴离子交换蛋白1与P16蛋白在HeLa细胞中共表达

目的 在人宫颈癌细胞株(HeLa)中共表达具有阴离子转运活性的阴离子交换蛋白(anion exchanger 1,AE1)与P16蛋白,观察两者之间的相互作用.方法 用脂质体将目的基因转入HeLa,Western blot及免疫荧光方法验证蛋白表达及定位,描绘细胞生长曲线,运用6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉铵(SPQ)测定细胞阴离子转运活性.结果 P16和AE1均成功在HeLa细胞中过表达.共同转染pEGFP-C1-p16和pRBG4-AE1后HeLa细胞的阴离子交换功能明显增强,且细胞增殖能力明显下降.结论 P16与AE1之间存在相互作用和/或协同作用,为进一步研究AE1在细胞增殖和肿瘤发生、发展过程中作用奠定了基础.     

钙敏感受体对人单核巨噬细胞株THP-1细胞因子分泌功能的影响

目的 探讨钙敏感受体(Calcium sensing receptor,CaSR)对THP-1源性巨噬细胞分泌细胞因子能力的影响。方法 首先将人单核细胞株THP-1用佛波脂(PMA,100 nmol/L)诱导,使之转化为具有贴壁能力的巨噬细胞株THP-1(以下简称THP-1)。用CaSR特异激动剂氯化钆(GdCl₃,1 mmol/L)处理细胞后,用ELISA法检测CaSR的激活对THP-1分泌细胞因子IL-1β、TNFα的影响,并利用Western Blotting方法检测NF-κB信号通路中p65、p50和IκBα蛋白的表达变化。结果 (1)用GdCl₃处理后,THP-1细胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量明显升高,但该作用可被CaSR特异抑制剂NPS2390(10 μmol/L)抑制;(2)在Gd³⁺作用组,THP-1细胞中NF-κB-p65表达明显上调,同时伴有IκBα的减少;在NPS2390预处理组,Gd³⁺所引起的NF-κB-p65和IκBα变化被抑制;各组NF-κB-p50变化不明显。结论 CaSR的激活可能通过激活NF-κB信号通路促进THP-1源性巨噬细胞株分泌细胞因子IL-1β、TNF-α,提示CaSR可能参与涉及单核巨噬细胞激活的各种疾病。     

多胺在异丙肾上腺素所致大鼠心肌肥厚中的作用及意义

目的： 研究多胺、鸟氨酸脱羧酶(ODC)及精脒/精胺乙酰基转移酶（SSAT）在异丙肾上腺素所致大鼠心肌肥厚中的作用及机制。方法: 异丙肾上腺素（ISO）皮下注射复制大鼠心肌肥厚模型,应用反向高效液相色谱（RP-HPLC）、RT-PCR和Western blotting结合图像分析系统,分别检测ISO作用不同时点大鼠心肌组织多胺含量、ODC和SSAT mRNA和蛋白的表达。结果: 与对照组比较,心脏重量参数在ISO注射后7 d时显著增加,ISO注射后1 d时腐胺含量增加（P<0.05）,5 d、7 d时显著增加（P<0.01）;精脒含量在ISO注射后3 d时开始增加,ISO注射后7 d时增加显著（P<0.01）,精胺含量略有增多（P<0.05）,总多胺池显著增加。心肌组织ODC和SSAT的 mRNA表达在ISO注射后1 d时升高(P<0.05或P<0.01）,并持续在较高水平。心肌组织ODC和SSAT的蛋白表达分别在ISO注射后1 d和ISO注射后5 d时升高,ISO注射后7 d时显著升高（P<0.01）。结论: 大鼠心肌组织多胺含量增加和ODC、SSAT的表达增强可能参与ISO所致心肌肥厚的病理过程。     

p16蛋白过表达对哺乳动物细胞带3蛋白阴离子交换功能的影响

目的: 研究p16过表达对HeLa细胞带3蛋白(band 3)阴离子交换功能的影响。方法:细胞免疫组织化学法检测HeLa细胞中p16和带3蛋白的表达。采用PCR方法将p16 cDNA亚克隆到pEGFP-C1上,经双酶切和DNA测序鉴定后将其转染HeLa细胞,在荧光显微镜下观察细胞转染效率。应用6甲基-3-磺丙基-1-喹啉-水化合物(SPQ)荧光探针检测带3蛋白的阴离子交换功能。结果:在HeLa细胞中p16和带3蛋白表达均为阳性。双酶切和DNA测序结果证明所扩增的p16 cDNA序列与报道序列相同。细胞转染后在荧光显微镜下可观察到60%以上的细胞发出荧光。转染pEGFP-C1-p16后细胞的阴离子交换功能增强。结论:p16对HeLa细胞带3蛋白的阴离子交换功能有促进作用。     

阴离子交换蛋白1在HEK293t细胞中的高效表达与鉴定

目的在人胚肾HEK293t(293t)细胞高效表达具有阴离子转运活性的阴离子交换蛋白1(AE1)。方法用传统磷酸钙转染法将质粒pRBG4-AE1转入293t细胞,免疫荧光及Western blotting验证蛋白表达及正常的细胞膜定位后,应用6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉铵(SPQ)观察表达的AE1是否具有阴离子转运活性。结果在293t细胞中,显示AE1高效表达。转染pRBG4-AE1后293t细胞相对于正常以及转染空载体对照组的阴离子交换功能明显增强。结论利用传统磷酸钙转染法,在293t可高效表达具有正常跨膜拓扑结构及阴离子转运活性的AE1,为进一步研究其相关功能奠定了基础。     

多胺在L-精氨酸抑制异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚中的作用

目的： 研究多胺在L-精氨酸抑制病理性心肌肥厚中的作用及机制。方法：异丙肾上腺素（ISO）皮下注射复制大鼠心肌肥厚模型,L-精氨酸作为干预因素,检测心脏肥大指数,心肌组织胶原染色,心房利钠肽（ANP）的转录水平,观察L-精氨酸对心肌肥大的影响;不同时段,应用高效液相色谱仪（HPLC）测定心肌组织内多胺含量,应用Western blotting结合图像分析系统,检测各组大鼠心肌组织鸟氨酸脱羧酶（ODC）和精眯/精胺乙酰转移酶（SSAT）的蛋白表达水平;检测血清NO含量和NOS活性。结果：皮下注射ISO7d后,心肌肥大指数增加,心肌纤维增粗、排列紊乱,ANP mRNA表达增加;L-精氨酸干预可抑制ISO诱导的心肌肥大,随着L-精氨酸作用时间延长,心肌组织多胺含量减少,血清NOS活性增强,NO含量增加。同时,ODC蛋白表达下调,SSAT蛋白表达上调。结论：L-精氨酸抑制ISO诱导的心肌肥大,其机制可能与下调L-精氨酸/多胺通路、上调L-精氨酸/NO通路有关。     

病理生理学教学中的几点体会

病理生理学一直被学生认为是一门较难掌握的学科。青年教师在病理生理学的教学工作中,更应该顺应社会需要,提高自己的道德素质,完善自己的知识结构,更新观念,成为一名知识水平、人格魅力、职业道德都经得住考验的优秀教师。     

miR-580对乳腺癌细胞系中Twist1的调节作用

目的:探讨miR-580在MCF-10A细胞系中对于Twistl的调节。方法:本实验利用生物信息学方法预测Twistl的靶miRNA是miR-580。首先,采用qPCR法检测在MCF-10A系列细胞系中Twist1及miR-580的表达。然后,在MCF-10A细胞系中分别转染miR-580类似物和miR-580抑制物后,利用RT-PCR、Western blot、t检验分析Twistl的表达及细胞迁移能力的变化。最后利用荧光素酶实验验证miR-580通过结合在Twistl的3'UTR调节其表达。结果:1)在MCF-10A细胞系中Twist1与miR-580的表达呈负相关;2)在MCF-10A细胞系中转染miR-580类似物后,Twist1的表达下调;在MCF-10A细胞系中转染miR-580抑制物后Twistl的表达上调;3)在MCF-10A细胞系中引人miR-580类似物后细胞迁移能力降低;4)miR-580直接结合在Twistl的3'UTR。结论:miRNA-580在MCF-10A细胞系中通过结合在Twistl的3'UTR负向调节Twist1的表达从而克制细胞的迁移。