真核表达载体pIRES2-EGFP-PELP1的构建及其在人牙周膜干细胞中的表达

目的 克隆人源脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1(proline-,glutanic acid-,leucine-rich proteinl,PELP1)基因全长,构建PELP1基因全长过表达载体,研究PELP1基因表达特点,为PELP1基因在不同组织细胞中的功能性研究奠定基础.方法 采用反转录PCR法从MCF-7细胞总RNA中克隆PELP1基因全长,与含有EcoR I与Xho I双酶切位点的真核过表达载体pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PELP1.经双酶切及测序鉴定重组质粒中PELP1基因的完整性及正确性.运用脂质体将重组质粒转染至人牙周膜干细胞中,运用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)及蛋白质印迹法分别从基因和蛋白水平对转染细胞中PELP1的表达进行检测.结果 成功克隆出PELP1基因全长,并将其插入至pIRES2-EGFP过表达载体中,经双酶切鉴定和测序鉴定证实目的质粒片段插入无误.重组质粒pIRES2-EGFP-PELP1转染48 h后PELP1基因水平是转染空质粒人牙周膜干细胞的(148.0±1.3)倍,二者差异有统计学意义(P＜ 0.005).蛋白质印迹法结果显示,与转入pIRES2-EGFP的人牙周膜干细胞中PELP1蛋白相对表达量(0.3300±0.0117)相比,转入pIRES2-EGFP-PELP1重组质粒的人牙周膜干细胞中PELP1蛋白相对表达量(0.6200 ±0.0045)显著增高,二者差异有统计学意义(P＜ 0.005).结论 本项研究成功运用qRT-PCR反应从MCF-7细胞中克隆出PELP1全长基因,并成功构建pIRES2-EGFP-PELP1真核过表达载体.     

孕妇维生素D缺乏及其对胎儿的影响

目的维生素D缺乏累及的人群非常广泛,而且与多种疾病的发生有关,特别是孕妇维生素D缺乏还可能影响到胎儿的健康。目前关于我国女性维生素D的资料报道很少。本研究的目的是了解健康孕妇(孕15~21w)以及同龄未孕对照组妇女维生素D水平以及孕妇维生素D水平对新生儿出生大小的影响。方法本文随机选取单胎妊娠孕妇63例和同龄对照妇女35例,用酶联免疫的方法测定血中25-羟维生素D水平。结果显示99%的检测病例25-羟维生素D水平低于正常值(≥75 nmol/L),有近93%的妇女为维生素D缺乏(50 nmol/L)。孕妇25-羟维生素D水平(28.40±9.19 noml/L)明显低于对照组妇女(38.46±10.77 noml/L;P0.001),两组维生素D缺乏的比率分别为孕妇96.8%,对照组85.7%,但重度维生素D缺乏的病例孕妇组接近半数,而对照组为零。新生儿身长与孕妇25-羟维生素D水平成显著正相关(r=0.323;P0.01。结论我国北方女性特别是孕妇是维生素D缺乏患病的高危人群,而且孕妇维生素D缺乏可能会影响到胎儿的生长发育。应该积极采用有效的措施防治维生素D的缺乏,从而减少维生素D缺乏对健康的影响对提高人口质量将具有重要的意义。     

脐带绕颈7周新生儿存活一例

脐带绕颈７周新生儿存活一例解放军５１４医院宋淑军孕妇２４岁，因停经３９＋１周、阵痛３ｈ，于１９９４年７月４日入院，以往月经规律，身体健康，Ｇ２Ｐ０Ｌ１。本次妊娠自３３＋３周开始孕期检查，诊为臀位，嘱孕妇取膝胸卧位，半月后检查仍为臀位，产前又检查２次均...     

受体介导的凝血酶对成骨细胞增殖及分化的作用

目的 通过凝血酶对成骨细胞的增殖及分化作用的研究来探讨受体介导的凝血酶的功能.方法 原代成骨细胞分别取自于蛋白酶激活受体(protease-activated receptor,PAR)-1敲除鼠和野生对照鼠的头颅骨.并利用凝血酶,人工合成的PAR-1或PAR-4特异性激活短肽对细胞进行处理,通过对5.溴-2-脱氧尿嘧啶的嵌入及细胞碱性磷酸酶活性的测定探讨PAR-1或PAR-4激活对细胞增殖和分化的影响.结果 在野生鼠成骨细胞,凝血酶及PAR-1激活肽均能促进的细胞增殖和降低碱性磷酸酶的活性,但PAR-4激活肽却无这些作用.然而在PAR-1 敲除鼠的成骨细胞无论是凝血酶还是PAR-4激活肽均不能改变细胞的增殖及碱性磷酸酶的活性.结论 本研究结果 表明凝血酶促进成骨细胞增殖及抑制其分化是通过PAR-1介导的.其他凝血酶受体并不具有此作用.     

辛伐他汀在模拟微重力环境对成骨细胞增殖和凋亡的影响

目的观察辛伐他汀在模拟微重力环境下对成骨细胞增殖和凋亡的影响。方法利用沿水平轴连续回转(30 r/min)细胞培养系统模拟微重力环境,使用MTT比色法观察小鼠成骨样细胞MC3T3-E1的增殖情况;细胞凋亡是根据4,6-二氨基-2-苯基吲哚所染细胞核形态的改变来辨认。结果模拟微重力环境可以降低MC3T3-E1增殖功能,辛伐他汀在模拟微重力环境可以增强MC3T3-E1增殖功能,但对细胞的凋亡并无显著影响。结论在模拟微重力环境下辛伐他汀对成骨细胞增殖功能具有保护作用,为辛伐他汀治疗微重力环境骨丢失提供了理论和实验证据。     

雷奈酸锶:翻开了治疗骨质疏松的新篇章

雷奈酸锶是一个新型抗骨质疏松制剂,它和以前所用治疗骨质疏松的药物不同,其对骨代谢具有双重作用,即抑制骨吸收和促进骨的形成.尽管其机制尚不清楚,但在组织和细胞培养中,雷奈酸锶可以促进前成骨细胞的增生和分化,促进骨基质的合成.同时雷奈酸锶还可以抑制破骨细胞分化和破骨细胞活性并刺激破骨细胞凋亡.在体内,雷奈酸锶可使正常的大鼠和小鼠骨形成增强和骨吸收降低,并可改善骨的微细结构.在卵巢切除大鼠,雷奈酸锶在保持高水平骨形成的同时抑制骨吸收,增加骨量和骨的强度.在临床实验中,雷奈酸锶不仅可以增加血清碱性磷酸酶(骨的形成指标)的水平,并可降低血清C-交联端肽I型胶原(骨的吸收指标)的水平.组织测量学研究显示,雷奈酸锶可以使成骨细胞的表面和骨的矿物质沉积率增加,而骨吸收的参数下降.雷奈酸锶可降低椎骨以及非椎骨新发骨折的危险性.这些前临床和临床实验结果 显示雷奈酸锶是安全、有效的抗骨质疏松药物,其刺激骨形成和抑制骨吸收的双重作用使其有可能成为抗骨质疏松的理想药物.     

携带SEA和CD80双基因的重组腺病毒转染B16细胞体外诱导T淋巴细胞活化的研究

目的:观察恶性黑色素瘤B16细胞经重组腺病毒感染后,表达在B16细胞膜上的SEA和CD80体外能否诱导免疫学反应。方法:B16细胞分别经空载体腺病毒Ad(空)和重组腺病毒Ad-MMRE-mTERT-B7、Ad-MMRE-mTERT-SEA、Ad-MMRE-mTERT-BIS感染后,和小鼠脾淋巴细胞共培养,然后,采用Brdu 酶联免疫法（ELISA）检测淋巴细胞增殖;流式细胞术检测T淋巴细胞亚群增殖;ELISA法检测细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的产生。结果:与感染空载体腺病毒Ad(空)和未感染B16细胞相比,经重组腺病毒感染的B16细胞体外能够显著诱导脾淋巴细胞的增殖,其中CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞增殖显著;细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-2的产生显著升高;CTLs对肿瘤细胞的杀伤活性显著增强;表达双基因的B16细胞体外诱导免疫应答的能力高于单基因过表达B16细胞。结论:B16细胞经重组腺病毒感染后,表达在细胞膜上的SEA和CD80具有免疫学活性,本研究为今后进一步采用所构建重组腺病毒进行恶性黑色素瘤的免疫基因治疗提供了实验依据。     

维生素B 6和丰诺安对X射线辐照小鼠外周血细胞的保护作用及意义

目的观察维生素B₆和丰诺安(20AA复方氨基酸)对X射线辐照小鼠外周血细胞的保护作用。 方法将小鼠随机分为对照组、模型组、维生素B₆组、丰诺安组和联合组。除对照组外，其余4组小鼠均接受X线照射。从照射前4 d开始至照射后第10天，对照组和模型组腹腔注射等渗盐水，维生素B₆组、丰诺安组和联合组分别腹腔注射维生素B₆、丰诺安、以及维生素B₆和丰诺安的混合液，照射后第11天处死小鼠，检测小鼠血常规和外周血淋巴细胞亚群。 结果与对照组相比，X线照射小鼠外周血白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、红细胞、血小板、自然杀伤(natural killer cell，NK)细胞、总T细胞、CD4^＋和CD8^＋ T细胞数量和血红蛋白浓度均显著降低(P<0.05)；CD4/CD8比值升高(P<0.05)；丰诺安、维生素B₆和混合液均可显著提高X线照射小鼠的白细胞总数、淋巴细胞、血小板、NK细胞、B细胞、总T细胞、CD4^＋和CD8^＋ T细胞数量(P<0.05)；混合液在提高总T细胞数量[(41.94%±10.90%)比(32.14%±5.86%)]和CD4^＋ T细胞数量[(33.11%±10.00%)比(25.01%±4.64%)]效果上优于维生素B₆(P<0.05)，在提高白细胞总数[(6.3±0.6)×10⁹/L比(3.7±0.5)×10⁹/L]和淋巴细胞数量[(5.3±0.4)×10⁹/L比(3.4±0.3)×10⁹/L]效果上优于丰诺安组(P<0.05)。 结论维生素B₆和丰诺安对X射线辐照小鼠外周血细胞具有保护作用，维生素B₆和丰诺安联合应用优于单一应用。     

男性维生素D水平与血浆致动脉硬化指数关系的研究

目的探讨男性维生素D水平与血浆致动脉硬化指数之间的关系。方法选取2013年1月至2013年12月期间在解放军第306医院体检中心体检的男性934例,留取空腹静脉血,测定血清25-羟维生素D的水平;检测血清甘油三酯及高密度脂蛋白胆固醇,计算血浆致动脉硬化指数。分析25-羟维生素D水平与血浆致动脉硬化指数之间的关系。结果受试者25-羟维生素D水平为53.23±21.59 nmol/L,血浆致动脉硬化指数水平为0.10±0.30,两者呈明显的负相关(r=-0.10,P0.01)。维生素D缺乏组的血浆致动脉硬化指数明显高于维生素D正常组(0.13±0.30比0.08±0.29,P0.05)。血浆致动脉硬化指数异常组25-羟维生素D水平较血浆致动脉硬化指数正常组明显降低(51.35±21.06 nmol/L比54.66±21.90 nmol/L,P0.05)。结论男性维生素D水平与血浆致动脉硬化指数关系密切。因此,维持人体正常维生素D水平可能对预防动脉粥样硬化及相关疾病具有一定意义。     

mTERT启动子调控的CD80-SEA基因重组腺病毒载体的构建及在不同肿瘤细胞中的表达研究

[目的]构建小鼠端粒酶反转录酶(mTERT)启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体,并观察其介导的SEA和CD80在小鼠肝癌细胞Hepa1-6、结肠癌细胞CT26、黑色素瘤细胞B16和成纤维细胞NIH3T3中的表达情况。[方法]采用AdEasy腺病毒体系,亚克隆mTERT核心启动子区至穿梭质粒pShuttle2,并在其上游插入myc-Max反应元件MMRE,用来调控SEA及CD80基因的表达,构建SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS,转化Ad293细胞制备病毒并纯化,然后将病毒以感染复数为100的浓度分别感染上述四种细胞。采用免疫荧光染色法及流式细胞术检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达情况。[结果]以感染复数为100病毒量感染上述细胞后,CD80和SEA的不同肿瘤细胞上表达率不同,而病毒感染的NIH3T3细胞不表达SEA和CD80。[结论]成功地构建了mTERT启动子调控的SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,能够调控SEA和CD80基因在不同肿瘤细胞中的靶向表达,但表达效率有所不同。为进一步采用同一腺病毒对不同肿瘤细胞的进行靶向基因治疗研究奠定了基础。