霍乱弧菌溶原性噬菌体CTXΦ的氯霉素抗性基因标记及诱导

目的　对携带霍乱毒素基因的溶原性噬菌体CTXΦ进行遗传标记 ,以深入研究CTXΦ对霍乱弧菌的转染机制。方法　将CTXΦ基因组中ctxAB的上下游同源序列连接到cat基因的两侧 ,然后通过自杀质粒介导的DNA同源重组技术将霍乱菌株N16 96 1染色体上CTXΦ基因组中的ctxAB基因缺失掉 ,替换以氯霉素抗性基因 ,对CTXΦ基因组进行遗传标记 ,然后用丝裂霉素C诱导这种经抗性基因标记的噬菌体 ,再利用它对古典型霍乱弧菌的转染检测活性。结果　获得了ctxAB缺失、带有cat遗传标记的重组菌株N Φc;诱导出的CTXΦc噬菌体颗粒成功感染了霍乱菌株 1119。结论　N Φc中的CTXΦ带有了氯霉素抗性标记 ,诱导出具有感染活性的CTXΦc可用于研究毒力基因的水平转移     

霍乱弧菌的一种新的不含毒素基因CTXΦ基因组的复制功能研究

引起霍乱流行的霍乱弧菌菌株在遗传方面的一个重要特点是都带有霍乱毒素（CT）的基因ctxAB.对O139群菌株的分析中，发现一种新的不含ctxAB的CTXΦ基因组，其中的rstR基因和ig-2区与已发现的CTXΦ基因组的相应序列无明显同源性，     

霍乱弧菌O139菌株的分子生物学特征

为阐明Ｏ１３９霍乱弧菌的主要分子生物学特征，并为探讨其来源提供科学依据，应用核酸脉冲场凝胶电泳、基因探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交等方法，对国内外分离的２３株Ｏ１３９菌和一些Ｏ１群菌株进行分析。结果表明，所有Ｏ１３９菌株均表现为一致的且具有特征性的酶切图谱；它们与埃尔托型流行株的图谱较与古典型菌株图谱更为相似，与埃尔托非流行株和其他非Ｏ１菌株的遗传差异较大。在ＳｍａＩ图谱中，新疆分离的Ｏ１３９菌株显示出与当地１９８９年分离的埃尔托型流行株较接近的图谱；Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ结果显示在不同的酶切图谱分子杂交（ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩｃｔｘ，ＢｇｌＩ１６ｓｒＲＮＡ）中，Ｏ１３９菌株与Ｏ１流行株之间有一定的差异；我国分离的Ｏ１３９菌株具有一致的图谱，与印度和孟加拉国分离的Ｏ１３９菌株之间有较小差异；新疆分离的Ｏ１３９菌株与该地１９８９年分离的某些ＥＶＣ流行株的图谱相似。基因检测表明，Ｏ１３９菌株都具有ｃｔｘ、ｚｏｔ、ａｃｅ和ＲＳ１；ＭＥＥ分析表明，Ｏ１３９菌株的ＥＴ型与ＥＶＣ流行株不可区分。     

我国伤寒沙门氏菌的分子流行病学特征Ⅱ．部分伤寒沙门氏菌的16SrRNA基因多态性

利用ＰＣＲ扩增标记的Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ－１６ＳｒＲＮＡ基因为探针，分析我国不同时间和地区分离的１１９株伤寒沙门氏菌和１株鼠伤寒沙门氏菌染色体经ＰｓｔⅠ消化后的１６ＳｒＲＮＡ基因限制性图谱。结果发现，各菌株的杂交片段范围为７．０～２６．５ｋｂ，每个菌株有５～１０条杂交带不等。通过对每个菌株的杂交结果进行数值分类，１１９株伤寒沙门氏菌可分为３８个ＲＴｓ，其中新疆伊犁１９９１年流行菌株和大连１９９０年爆发菌株大部分（１３／２０）为同一ＲＴ；从国内各高发省份分离的一些流行株也有相同的ＲＴ；而一些地区的散发菌株具有独特的ＲＴ；鼠伤寒沙门氏菌的ＲＴ则更为特别。对３９个ＲＴｓ，进行聚类分析发现：国内的一些流行菌株，爆发菌株在遗传距离０．５５处聚成一大类；而散发菌株，非流行菌株则在０．７０处聚成另一类。此外，从健康带菌者分离的菌株２５１所具有的ＲＴ单成一类。鼠伤寒沙门氏菌的距离更远。     

一种新的编码霍乱毒素的丝状噬菌体CTAKΦ

目的 探讨介导霍乱弧菌毒素基因水平转移的一种独特的遗传结构。方法 从O139群霍乱弧菌菌株FJ97129上清中分离出丝状噬菌体颗粒CTAKΦ，并进行电镜观察。从丝状噬菌体颗粒CTAKΦ中纯化出DNA，并进行链型分析。对pCTAK进行酶谱分析。用ctxAB、zot引物对pCTAK进行PCR扩增检测，用RS1探针对pCTAK进行Southern blot检测；用pCTAK转化DH5α和IEM101得到DX29和4329，将pCTAK克隆于pUC18载体并转入DH5α得到UD29，用GM1－ELISA检测DX29、4329、UD29的CT表达。对pCTAK的ctxAB、zot基因片段进行测序，并用DNASTAR软件和BLAST算法，在国际互联网上对测序结果进行序列分析。结果 发现和分离了一种编码霍乱毒素的质粒pCTAK，它以稳定的高拷贝数存在于1株天然的O139霍乱弧菌FJ97129中；酶谱分析发现其明显不同于CTX元件酶谱，在CTX元件中相当保守的酶切位点：BglⅡ、EcoRⅤ、PstⅠ、EcoRⅠ，在pCTAK中没有切点。ctxAB、zot引物对pCTAK的PCR扩增检测呈阳性，RS1探针杂交呈阳性；pCTAK的ctxAB、zot基因序列与已报道的序列有很高的同源性。pCTAK能直接或经载体转化DH5α和IEM101并表达CT。从FJ97129培养上清中分离出丝状噬菌体颗粒CTAKΦ，电镜观察并计算其直径大小为7nm左右。其全基因组大小为8.5kb，为单链DNA。结论 发现了一种新的编码霍乱毒素的丝状噬菌体CTAKΦ。     

El Tor型霍乱弧菌口服活疫苗候选株IEM108的构建

目的 构建能够诱导抗菌抗毒素免疫和抵抗CTXΦ转染的霍乱弧菌生物安全性口服活疫苗候选株。方法 以不产毒的EI Tor型霍乱弧菌疫苗候选株IEMl01为出发菌株，以管家基因thyA为选择压力，在IEMl01的thyA基因缺失株IEMl01-T中，通过质粒．染色体致死平衡系统表达霍乱毒素B亚单位基因ctxB和介导CTXΦ噬菌体免疫的rstR基因。在家兔模型中，通过检测血清杀弧菌抗体和抗CTB的IgG抗体来评价该新建疫苗候选株的免疫原性；以对家兔攻毒试验后肠段积液量来评价其保护力。结果 含ctxB、rstR和大肠杆菌来源的thyA基因的重组质粒在：IEMl01-T中稳定存在，GMI-ELISA检测ctxB基因能够很好表达。动物试验表明，该新建疫苗候选株能刺激机体产生高滴度的血清杀弧菌抗体和抗CTB IgG抗体，能较好抵抗至少4μg纯品CT和不同毒株的攻击。结论 应用质粒．染色体致死平衡系统构建了能抵抗CTXΦ转染和稳定表达ctxB的生物安全性抗菌抗毒口服活疫苗候选株，其在家兔模型中有较好的免疫原性和保护力。     

O139霍乱弧菌CTAKΦ的基因水平转移的研究

目的 探讨CTAKΦ介导的霍乱弧菌毒素基因水平转移。方法 用抗生素敏感试验筛选出几组基因水平转移试验组合的供、受体菌，以便于用抗性筛选来确定基因转移的情况。在这几组试验组合中分别用接合转移、上清水平转移、培养液水平转移的方法，检查供体菌将CTAKΦ的A^RK^R抗性转移给受体菌的能力。结果 供体菌FJ97129、DX29能通过多种转移方式，以很高的频率将CTAKΦ的A^RK^R抗性转移给受体菌HK42、XJ93172、GD3188、7763、569B和94001；而受体菌IEM101对CTAKΦ有一定的抗感染能力。结论 CTAKΦ能够介导霍乱弧菌中霍乱毒素基因的水平转移。     

报告基因融合系统在研究细菌基因功能方面的应用

２．ｐｈｏＡ和ＴｎｐｈｏＡ系统［７，８，２７～３０］：碱性磷酸酶的氨基端部分序列对其表达酶活性非必需，当缺少氨基端（除信号肽以外）达１３个氨基酸时，碱性磷酸酶融合蛋白仍能显示同野生型相同的酶活性，但当３９或更多氨基端氨基酸缺失时，酶活性明显下降。比如...     

我国O139群霍乱弧菌的分子特征和分子流行病学

霍乱是由霍乱弧菌引起的一种烈性传染病,我国在《传染病防治法》中将之列为甲类传染病。目前能引起大范围流行的仅有O1群和90年代以来开始的O139群,我国发生的霍乱流行均由这两群引起。O139群霍乱弧菌是迄今为止的首个由非O1群霍乱弧菌引起暴发和大范围流行的血清群。明确O139群菌株与其它群菌株的相互关系以研究其来源,对于新病原体产生的假设以及霍乱菌苗的设计     

O139霍乱弧菌中存在编码霍乱毒素的质粒

长期以来 ,由于霍乱弧菌有丰富的外泌ＤＮＡ酶等原因 ,使得质粒在霍乱弧菌中的转化效率非常之低 ;前人对霍乱菌株质粒进行过广泛深入的研究 ,但未见报道携带有霍乱毒素基因的霍乱质粒 ,这使研究者们渐渐倾向于认为 ,质粒在霍乱毒素基因的水平转移过程中很难发挥作用。本文首次报道了在Ｏ1 3 9霍乱弧菌中存在编码霍乱毒素的质粒。我们从数株天然Ｏ1 3 9菌株中检测出含质粒的菌株 ,从中选择并制备 4～1 0ｋｂ的质粒 ,用ｃｔｘＡＢ、ｚｏｔ、ＲＳ1探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交 ,杂交阳性的质粒见表 1。直接从天然Ｏ1 3 9菌株质粒中检测出ＲＳ1…