人FcγRⅡ真核表达质粒的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:建立稳定表达人FcγRⅡ(human Fc gamma receptor Ⅱ ,huFcγRⅡ)的真核细胞系,为后续研究奠定基础.方法:采用RT-PCR方法从人外周血白细胞合成FcγRⅡcDNA,构建huFcγRⅡ表达质粒pcDNA3-huFcγRⅡ,经酶切和PCR鉴定后,将pcDNA3-huFcγRⅡ质粒通过脂质体转染法转染COS7细胞,并经G418筛选获得稳定表达huFcγRⅡ的细胞克隆.采用免疫荧光法和玫瑰花环试验检测huFcγRⅡ的表达.结果:构建的pcDNA3-huFcγRⅡ真核表达质粒经酶切鉴定与预期一致,稳定转入COS7细胞后,经免疫荧光染色,约90%的转染细胞可见荧光,而未转染的COS7对照细胞未见荧光.结论:成功构建pcDNA3-huFcγRⅡ真核表达质粒,建立了稳定表达huFcγRⅡ的细胞系,为进一步研究奠定了基础.     

橘皮栗子粥

原料：橘皮15克，粟子粉30克，糯米50克。     

小鼠FcγRⅢ原核表达、纯化及鉴定

目的: 制备纯化重组蛋白mFcγRⅢ,并鉴定其生物学活性.方法: 从克隆载体mRⅢ-T中扩增mFcγRⅢ胞外区,构建原核表达载体pETmRⅢ,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot对重组表达蛋白进行鉴定;表达产物通过包涵体纯化后用稀释方法复性;ELISA检测复性蛋白活性.结果: 成功构建了重组表达质粒pETmRⅢ,纯化和复性了重组蛋白mFcγRⅢ;复性的重组蛋白mFcγRⅢ具有较强的体外活性.结论: 原核重组蛋白mFcγRⅢ复性后具有较强的体外结合配体特性,为探索重组蛋白治疗自身免疫病奠定了基础.     

原核表达、稀释复性的人FcγR Ⅱ a恢复IgG的结合功能

目的 探讨原核表达稀释复性的可溶性人FcγR Ⅱ a(shuFcγRⅡa)的胞外区蛋白在体外与配体的结合活性.方法 应用PCR技术从重组质粒pc3huR Ⅱ中扩增huFcγR Ⅱ a的胞外区基因,将其克隆于原核表达载体pET-28a中.所构建的重组质粒经PCR和酶切鉴定后转化大肠杆菌B121(DE3),IPTG诱导表达,制备融合蛋白包涵体.并采用多次洗涤法分离和纯化包涵体,用稀释法对纯化后的目的 蛋白进行复性,ELISA和流式细胞术测定重组shuRⅡ在体外与配体的结合活性.结果 扩增到了huFcγRⅡa的胞外区基因,所构建的pETshuRⅡ重组质粒经PCR和酶切鉴定与设计序列一致.转化BL21(DE3)后,IPTG诱导目的 蛋白表达率约为30%.SDS-PAGE初步测定目的 蛋白的相对分子质量(Mr)约为24.8×103,与理论预期值一致.破菌后电泳证实目的 蛋白主要以包涵体形式表达,经多次洗涤后蛋白纯度大于90%.ELISA法测得重组shuRⅡ与人IgG在体外有良好的结合活性,流式细胞术测得重组shuRⅡ对配体与受体结合有抑制作用.结论 本复性方法可得到和天然蛋白类似生物学活性的目的 蛋白.     

鸡B淋巴细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建与鉴定

目的:构建鸡B淋巴细胞cDNAT7噬菌体表达文库并对文库质量进行鉴定。方法:利用oligo(dT)-纤维素亲和层析从SPF雏鸡法氏囊细胞制备mRNA,合成的双链cDNA定向克隆到T7EcoR I/HindIII载体臂,包装并构建cDNA表达文库。对文库进行滴度测定和重组子测定。扩增文库并进行PCR鉴定插入序列的长度及分布。结果:文库初始滴度为5×107pfu/mL,扩增后滴度达到1.88×1010pfu/mL。插入片段平均长度1440bp,主要分布在750～2000bp之间。结论:构建的鸡B淋巴细胞cDNAT7噬菌体表达文库具有很高的质量,为进一步研究鸡B细胞发育以及传染性法氏囊病毒(IBDV)的分子致病机制奠定了实验基础。