双重实时荧光PCR快速鉴别人参和西洋参＊

目的 建立一种能够快速鉴定人参和西洋参的双重实时荧光PCR方法。方法 通过对人参属及其近似种基因序列的分析比对，设计特异性的引物探针，建立双重实时荧光PCR检测方法。PCR反应体系为Premix Ex Taq （Probe qPCR） 10 μL，人参上下游引物各0.5 μL，西洋参上下游引物各0.3 μL，人参与西洋参特异性探针各0.4 μL，DNA模板2 μL，灭菌去离子水补至20 μL。反应条件为95℃预变性30 s；然后以95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s进行40个循环。应用该方法测试了27份DNA样品，包括7份人参、6份西洋参、4份人参与西洋参混合样、10份其他人参属样品及其他常见中药材样品的DNA，以确定该方法的特异性。将人参与西洋参样品DNA混合后10倍稀释成不同浓度后进行检测，用以确定该方法的灵敏度。结果 人参及西洋参样品均在特定的荧光通道下出现典型的阳性扩增曲线，人参与西洋参混合样品均同时出现两条阳性扩增曲线，其它对照样品及空白对照均没有出现阳性扩增曲线。灵敏度检测结果显示该方法检测人参及西洋参的最低检测限均为2 pg DNA/反应。结论 本实验建立的双重实时荧光PCR方法能够同时快速、准确、灵敏地鉴别出人参和西洋参。     

基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的建立

目的建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)检测方法。方法提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后,使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)分别进行酶切;根据松弛环状DNA(rcDNA)和cccDNA的结构差异,设计特异性扩增HBV cccDNA的引物,对酶切后的产物进行滚环扩增(RCA)和PCR扩增;并筛选crRNA,建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果利用α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和HBV表面抗原(HBsAg)引物对双重酶切后的产物进行扩增,验证产物中HBV基因组的存在;利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增,验证了产物中只存在HBV cccDNA;利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释,然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测,计算出检测下限为10拷贝/μl。结论本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法,可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测,为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。     

经聚乙烯亚胺钝化的荧光碳点负载阿霉素抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移侵袭的治疗研究

目的研究利用经聚乙烯亚胺（PEI）钝化的荧光碳点（CD）装载阿霉素（DOX）进行药物递送，旨在增加DOX对非小细胞肺癌的治疗作用，减少DOX的心肌毒性。 方法通过一步微波加热法将甘油和PEI的混合物制备成CD-PEI，并通过静电效应将DOX装载至CD-PEI。采用CCK8实验检测CD-PEI-DOX对非小细胞肺癌细胞A549的增殖能力的影响；Transwell实验评估CD-PEI-DOX对A549细胞迁移侵袭能力的影响；最后通过体内动物实验评估CD-PEI-DOX的心肌毒性以及对非小细胞肺癌皮下肿瘤生长的抑制效果。 结果体外细胞实验证实，对比单纯的DOX处理组，CD-PEI-DOX对非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭能力的抑制作用更为显著。体内实验证实，CD-PEI-DOX纳米复合物治疗组小鼠心肌细胞结构完整，并且能有效抑制小鼠皮下肺癌肿瘤的生长。 结论经PEI钝化的荧光碳点负载阿霉素能显著提高DOX对非小细胞肺癌的治疗效果，并减少DOX对心脏的毒性作用。运用CD-PEI纳米颗粒改善化疗药物递送的治疗方案取得了初步证实，这可为肺癌化学治疗提供新思路，具有广大的临床应用前景。     

少见部位结节性筋膜炎临床病理及分子遗传学特征

目的探讨少见部位结节性筋膜炎(nodular fasciitis, NF)的临床病理、免疫表型及分子遗传学特征。方法收集河南省人民医院病理科2015年1月至2021年1月诊治的50例NF患者的临床及病理资料, 其中少见部位14例, 采用免疫组织化学染色检测相关蛋白的表达情况, 采用荧光原位杂交(FISH)检测USP6基因断裂情况。结果 14例少见部位NF中, 男性、女性各7例, 位于肢端、会阴部、乳腺、腕关节内、腰4/5椎间隙, 其中8例存在少见组织累及(骨骼肌内6例、神经根1例、血管内1例), 肿瘤边界不清, 呈浸润性生长, 梭形肌纤维母细胞束状或杂乱排列, 形态温和, 可见小核仁及多少不等核分裂象, 间质胶原化至黏液样变, 可见红细胞外渗及炎性细胞浸润;免疫组织化学示梭形细胞局灶或部分表达平滑肌肌动蛋白, 弥漫强表达p16。FISH示14例中12例存在USP6基因断裂, 其中2例发生于胸壁骨骼肌内者同时合并USP6基因红色信号扩增。结论少见部位NF具有与经典部位相似的临床病理和遗传学特征, 但肿瘤组织边界多呈浸润性生长, 存在非特异性p16强表达和USP6红色信号扩增现象。少见部位...     

一种基于N基因的麻疹病毒实时荧光RT-PCR检测技术

目的引进一种以检测麻疹病毒N基因为目标的荧光RT-PCR技术并运用到新余市麻疹常规监测工作。方法新荧光RT-PCR与国产的荧光RT-PCR试剂盒、IgM抗体ELISA检测试剂盒分别对新余市2014年所采集麻疹疑似病例咽拭子、血清样本进行检测和结果分析。结果新荧光RT-PCR、国产的荧光RT-PCR试剂盒、ELISA试剂盒的检测阳性率分别为25.53%、23.4%、17.02%。与ELISA相比,RT-PCR具有更好的检测灵敏度,且两种荧光RT-PCR之间的总符合率达到97.87%。结论新引进的方法很敏感,适用于麻疹实验室监测以及疑似病例的快速诊断。     

荧光染色法与改良膨胀萎陷法判定段间平面在解剖性肺段切除术中的病例对照研究

目的相较于目前常用的改良膨胀萎陷法，探讨荧光染色法判定段间平面在胸腔镜解剖性肺段切除术中的可行性及安全性。 方法回顾性分析解放军总医院第一医学中心胸外科2017年3月至2019年9月行胸腔镜解剖性肺段切除术的157例临床资料，其中荧光染色组60例，女41例、男19例，年龄36～76岁；改良膨胀萎陷组97组，女62例、男35例，年龄27～85岁。荧光染色组采用反向染色法，分离出预切除肺段的肺动脉分支并切断，经外周静脉快速推注吲哚菁绿25 mg行保留肺脏部分的荧光显影从而判定段间平面。改良膨胀萎陷法，在分离出预切除肺段的支气管分支并切断后，双肺通气使肺脏完全膨胀后恢复单肺通气，一段时间后可形成较明显的段间平面。记录两组的临床资料并进行统计学分析。 结果与改良膨胀萎陷组相比，荧光染色组的段间平面形成时间更早、手术时间缩短，两组差异具有统计学意义[20 s(8～25 s)比1 008 s(884～1 200 s)，P＝0.031；(103.3±7.3)min比(132.8±10.4)min，P＝0.021]；两组的术中出血量、淋巴结清扫数目、术后置管时间、术后住院时间、并发症发生率比较，差异无统计学意义(P均>0.05)。 结论相较于目前常用的改良膨胀萎陷法，荧光染色法术中不需反复膨肺，同样符合肿瘤学要求，是安全、有效的。