古尔图病毒核蛋白的原核表达纯化及ELISA检测方法的建立

目的获得纯化的GTV-rNP蛋白抗原, 并建立快速准确检测GTV抗体的ELISA法。方法人工合成密码子优化的 GTV-NP 编码基因, 克隆至 pET32a(+)载体, 构建重组表达质粒, 转化至 BL21(DE3)。将优化表达获得的蛋白经Ni柱纯化后用SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化蛋白为抗原, 建立并优化GTV IgG抗体间接ELISA检测方法, 并对其进行评价和初步应用。结果成功构建原核表达质粒pET32a-NP, 重组蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达, 大小约为44 kD, Western blot结果表明重组蛋白与GTV阳性血清具有良好的抗原性。建立的ELISA法特异性强、敏感性高、批内和批间的变异系数均小于10%具有较好的重复性;检测结果与IFA检测结果符合率达到92.77%。结论建立的GTV NP 抗体检测ELISA方法的敏感性、重复性和特异性均较好。     

维吾尔族mtDNA及Y-STR遗传多样性研究进展

维吾尔族是新疆主要少数民族,人类历史上诸多民族及部落对现代维吾尔族的生成都有贡献,甚至可以说他们已经融合入现代的维吾尔族人群中。现有的历史记载和考古学资料难于解释历史较近的人群动态,故需要运用其他方法手段。以PCR扩增为基础的分子遗传学方法已成为探讨人群、种族迁演乃至人类的起源和进化的主导技术。本文主要对维吾尔族mtDNA及Y-STR遗传多样性研究进展做一综述。     

慢性束缚应激联合特殊饮食制备腹泻性肠易激综合征(IBS-D)大鼠模型的研究

目的观察饲料中的乳糖添加量、束缚时间和造模持续时间对腹泻型肠易激综合征(IBS-D)大鼠模型的影响,筛选一种较为理想的IBS-D大鼠模型的制备方法。方法将大鼠随机分为正常对照组、模型A组(30%乳糖+束缚1 h)、模型B组(30%乳糖+束缚1.5 h)、模型C组(45%乳糖+束缚0.5 h)、模型D组(45%乳糖+束缚1 h),以造模第7、10、14天腹壁回缩反射时的疼痛阈值评价其内脏敏感性,以腹泻指数评价其腹泻程度,同时以多道生理信号采集处理系统记录餐后1 h空肠平滑肌运动波,分析计算运动波振幅和频率,评价其胃肠动力。结果各组模型大鼠容量阈值在第7、10、14天均较正常对照组明显降低;腹泻指数在第7、10、14天均较正常对照组明显增加;其中模型D组发生较显著的平滑肌运动节律异常。结论在当饲料中乳糖比例在30%以上,束缚时间在1 h以上时,造模动物在7~14 d发生典型IBS-D的胃肠动力异常和内脏高敏感状态。     

骆驼刺提取物对腹泻型肠易激综合征模型大鼠水液代谢和胃肠激素水平的影响

目的探讨骆驼刺提取物对腹泻型肠易激综合征(D-IBS)大鼠水液代谢和胃肠激素水平的影响。方法将50只SD大鼠随机分成5组,每组各10只。除正常组(给予生理盐水灌胃)外,模型组(生理盐水)、骆驼刺提取物高剂量组(400 mg·kg~(-1))、低剂量组(200 mg·kg~(-1))和阳性对照组(曲美布汀60 mg·kg~(-1))采用传统束缚应激刺激联合高乳糖饮食建立D-IBS大鼠模型后再给予相应药物灌胃干预,每日给药1次。用药7 d后,计算粪便含水率;用药10 d后,进行腹部收缩反射(AWR)评分,并统计24 h内粪便粒数。采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定各组大鼠血浆中胃肠激素血管活性肠肽(VIP)、 5-羟色胺(5-HT)、 P物质(SP)和胃动素(MTL)的水平。结果与正常组比较,模型组粪便含水率、 AWR评分、 VIP、 5-HT、 SP和MTL水平均显著增加(P <0.01),大鼠24 h内粪便粒数明显减少(P <0.01)。与模型组相比,骆驼刺提取物高剂量组和低剂量组粪便含水率与AWR评分, 5-HT、 SP、 MTL水平均降低(P <0.05),大鼠24 h内粪便粒数明显增加(P <0.01)。其中,骆驼刺提取物低剂量组VIP水平与模型组相比降低(P <0.05),骆驼刺提取物高剂量组的VIP水平与模型组相比无显著差异(P> 0.05)。结论骆驼刺提取物可改善D-IBS大鼠肠道高敏感性和腹泻,其作用可能与降低VIP、 5-HT、 SP、 MTL的水平有关。     

新疆家蚕抗菌肽诱导人胃癌细胞AGS凋亡的研究

目的探讨新疆家蚕抗菌肽(cecropin XJ)是否通过诱导人胃癌细胞AGS凋亡产生抗肿瘤的作用。方法选择0.01~1 000 mg·L-1浓度范围内的cecropin XJ与人胃癌细胞AGS和人正常胃上皮细胞GES-1共培养24 h,采用MTT法检测cecropin XJ对AGS细胞和GES-1细胞增殖的影响;透射电镜观察细胞超微结构变化;Hoechst染色观察细胞凋亡情况;流式细胞术检测细胞内活性氧和线粒体膜电位的变化;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测Bax、Bcl-2、caspase-3以及细胞色素C mRNA和蛋白水平的表达变化。结果 Cecropin XJ在体外能明显抑制胃癌AGS细胞的增殖(P<0.05),并具有浓度依赖性,IC50值为61.19 mg·L-1,但对GES-1细胞无明显的抑制增殖作用。经cecropin XJ处理24 h后,AGS细胞核固缩,呈现典型细胞凋亡特征,同时细胞内活性氧增加,线粒体膜电位下降。qRT-PCR和Western blot结果表明,cecropin XJ能够引起Bcl-2表达下调,Bax表达上调,促进细胞色素C的释放并活化caspase-3。Cecropin XJ促进caspase-3活性呈剂量依赖,经caspase-3和caspase-9特异性抑制剂处理后可降低cecropin XJ介导的AGS细胞死亡率。结论 Cecropin XJ可通过下调Bcl-2表达,上调Bax表达和活化caspase-3诱导AGS细胞凋亡,是其抗肿瘤机制之一。     

不同途径的乳球菌介导重组IL-12基因抗小鼠黑素瘤的效果

利用自身免疫系统或其组分治疗肿瘤是一种新的治疗手段.白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)是一种具有多种生物学活性的免疫调节因子,它可以促进NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)的活性,能刺激T细胞及NK细胞的增殖,并诱导分泌IFN-γ等多种细胞因子[1],因此在抗肿瘤及抗感染中起重要作用.与其他细胞因子一样,直接应用IL-12会导致全身不良反应甚至危及生命.2003年Huber等[2]发现通过滴鼻给药可以降低IL-12介导的不良反应,此外有研究表明利用质粒、腺病毒或腺病毒转染的间质干细胞靶发送IL-12基因到肿瘤部位表达也能抑制肿瘤生长[3-5],而不致产生严重的不良反应.然而质粒发送存在缺乏组织的特异性和靶向性、转染效率较低且基因表达时间短[6]等缺点,发送重组腺病毒载体易导致转染细胞毒性及死亡、基因表达时间受限、可诱导机体产生免疫反应[7]等,限制了这些方式临床应用的效果.     

细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及生物学功能鉴定

目的在毕赤酵母中分泌表达细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(Echinococcus granulosus thioredoxin peroxidase,EgTPx),并检测其抗氧化活性。方法从包囊中分离原头蚴,抽提总RNA,采用RT-PCR获取EgTPx的cDNA片段并克隆至分泌型表达载体pPIC9K,构建重组表达质粒pPIC9K-EgTPx,电穿孔法转化毕赤酵母菌株GSll5,在MD平板上筛选His+克隆,采用梯度浓度G418抗性筛选高拷贝转化子,提取酵母基因组DNA,采用PCR鉴定Mut表型,阳性克隆经甲醇诱导表达EgTPx蛋白,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并检测其抗氧化活性。结果酶切和测序证实重组表达质粒pPIC9K-EgTPx构建正确,表达的目的蛋白分子质量单位约为22ku,该蛋白可被鼠抗EgTPx多抗识别,且具有较强的抗氧化活性。结论在毕赤酵母表达系统中成功表达了EgTPx,该蛋白具有免疫反应性和抗氧化活性。     

肝脏胰岛素抵抗与2型糖尿病

胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是因肝脏等靶组织对胰岛素敏感下降导致高胰岛素血症、糖耐量受损的一种病理性反应。IR作为2型糖尿病典型的病理特征,其发病机制是抗糖尿病研究的焦点。本文就糖尿病状态下的糖代谢、脂代谢、氧化应激、线粒体功能障碍、内质网应激、炎症与肝脏胰岛素抵抗相关信号通路的分子生物学机制进行综述,为糖尿病治疗提供新思路及理论指导。     

多糖抗2型糖尿病作用机制研究进展及分析

多糖是由10个以上单糖分子通过糖苷键连接形成的大分子化合物。多糖来源广泛、安全低毒,且具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、降血糖、降血脂等多种生物活性,受到研究学者的广泛关注。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一种以高血糖、胰岛素抵抗、低度炎症为特征的慢性代谢紊乱疾病。近年来,多糖对T2DM的治疗成为研究热点,多糖不仅能弥补阿卡波糖、双胍类和磺脲类等降糖药物长期治疗引起的低血糖、体质量增加、肠胃损伤等副作用,还能通过调节机体糖代谢、氧化应激、炎症反应、肠道菌群等发挥高效降糖作用。该文对多糖治疗T2DM的研究进展进行综述,并对化学修饰多糖的降糖活性等热点方向进行总结,为活性多糖降糖药物的开发及作用机制研究提供理论指导。     

研究基因功能的RNA干扰技术

人类基因组计划的实施 ,使基因组大规模测序工作已深入开展 ,人类积累了大量的基因序列数据 ,而这些序列大部分缺乏明确的功能注释 ,随着后基因组时代的到来 ,加速基因功能的研究已成为当务之急。人们对于某个基因功能的认识一方面通过分离突变体与野生型进行比较来确定 ,另一方面通过如反义抑制、目的基因超表达导致的共抑制等反向遗传学方法获得。而RNAi以其可大规模确定基因功能的优点 ,使其成为高通量分析日益增多的“新”基因的有效手段。1　RNAi的发现及特点很长时间以来 ,RNA仅仅被认为或者是作为mRNA分子起作用 ,或者作为翻译…