定向编辑CTLA4 基因的向导RNA体外合成体系的构建及其编辑效率

目的：基于CRISPR/Cas9 基因编辑技术原理体外合成定向编辑细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA4)基因的向导RNA(small guide RNA,sgRNA)。方法：（1）使用Crispr 网站对CTLA4 位点的sgRNA进行预测并设计出3 个sgRNA（sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3）,构建sgRNA 重组质粒,将其转染293T 细胞,48 h 后提取基因组DNA,利用T7EN1 核酸内切酶筛选活性较高的sgRNA序列;（2）以筛选到的sgRNA重组质粒为模板,设计引物并用PCR扩增体外合成sgRNA的DNA模板片段,进一步优化体外转录条件,转录出sgRNA,并利用Cas9 核酸酶体外检测转录纯化sgRNA的切割效率;（3）将sgRNA与转录得到的Cas9 mRNA 电转化入肺癌患者CD3+T细胞,实现靶基因敲除。结果：T7EN1 核酸内切酶实验证实了sgRNA2 序列靶向敲除效率最高,效率达到66%;优化体外合成体系后,转录得到的CTLA4 sgRNA2 产量高,具有较高的活性,在靶点上成功切开了DNA双链,Cas9 核酸酶检测出其切割效率达到了65%;最终可在肺癌患者CD3+T细胞中有效敲除CTLA4 基因,CTLA4 分子的表达从46%降低到22%,T7E1 核酸内切酶实验进一步证实了其编辑效率为56%。结论：体外成功构建了具有较高编辑效率的定向编辑CTLA4基因的sgRNA,为后续针对该基因制定相应的免疫治疗策略奠定了基础。