携带凋亡素基因的溶瘤腺病毒ATV对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用

目的:探讨携带凋亡素基因(apopptin)的溶瘤腺病毒ATV感染对人宫颈癌HeLa 细胞自噬和凋亡的影响。方法: 分别用携带凋亡素基因的溶瘤腺病毒ATV与对照病毒Ad-MOCK(均为前期工作构建）感染HeLa 细胞后，应用WST-1 法检测ATV感染对HeLa 细胞增殖的影响，流式细胞术检测ATV感染对HeLa 细胞凋亡和细胞周期的影响，Western blotting 法检测ATV感染对HeLa 细胞自噬相关蛋白LC3、P62 与mTOR表达的影响，MDC染色法检测ATV 感染对HeLa 细胞自噬水平的影响。结果:ATV感染后抑制HeLa细胞增殖，并具有一定的时间效应关系；以ATV 100 MOI感染72 h 后抑制率达到59.26%，其抑制能力明显强于同时间段对照组(P<0.01)。ATV 感染48 h，ATV 组HeLa 细胞凋亡率显著高于对照组[(38.995±4.009)% vs (14.680±1.174)%,P<0.01]。感染后的HeLa 细胞，随着ATV 作用时间的延长，S 期出现阻滞，48 h 阻滞最强，显著高于对照组[ 58.490±2.447)% vs (43.235±4.419)%，P<0.05]。与对照组相比，ATV 感染HeLa 后，LC3 表达量6、12 h 逐渐增高，12 h 达到最大值（P<0.01），24 h 表达量最低（P<0.01）；P62 蛋白在24 h 出现最高表达水平（P<0.01）；而mTOR随着作用时间延长逐渐降低（48 h 时，P<0.01）。荧光显微镜下可见HeLa细胞核周区域MDC阳性染色，随着ATV作用时间延长，自噬小体明显增多；与对照组相比，6、12h 自噬小体数量显著增多(28.000±2.828) vs (8.500±2.121), (37.000±4.243) vs (14.000±1.414)；均P<0.01]，24 h 相对减少[(12.000±2.828) vs (17.000±1.414)，P<0.01]。结论: 携带凋亡素基因的ATV溶瘤腺病毒可促进人宫颈癌HeLa 细胞的凋亡和自噬水平，进而特异性杀伤肿瘤细胞。     

BVDV-1 VLPs的构建及免疫原性研究北大核心CSCD

目的利用C、E0、E1和E2蛋白构建BVDV病毒样颗粒,并评价BVDV-1 VLPs的免疫原性。方法以BVDV-BA株为模板通过反转录得到C、E0、E1和E2基因,再将C、E0、E1和E2基因分别克隆至PEASY-Blunt Simple克隆载体上。提取质粒摇菌扩大培养,将得到的C、E0、E1和E2基因克隆至杆状病毒穿梭载体pFast Bac HTA中,采用热激法将重组穿梭质粒转化至DH10.Bac大肠埃希菌感受态细胞,通过蓝白斑筛选技术获得重组杆粒rB-C、rB-E0、rB-E1和rB-E2。将重组杆粒转染至SF9细胞,获得重组杆状病毒;再用构建的4种重组杆状病毒同时感染SF9悬浮细胞,72 h后收集细胞沉淀进行超声破碎,利用蔗糖垫超速离心和蔗糖密度梯度离心进行纯化,通过Western blot和透射电镜进行鉴定。将获得的BVDV-1 VLPs联合氢氧化铝佐剂免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体水平评价VLPs的免疫原性。结果成功克隆出C、E0、E1和E2基因,并构建C、E0、E1和E2蛋白的杆状病毒。通过纯化和鉴定,在20%~30%蔗糖层获得由C、E0、E1和E2蛋白组成结构完整的病毒样颗粒BVDV-1 VLPs。BVDV-1 VLPs能够显著增加免疫小鼠的特异性抗体表达水平。结论构建并获得了由C、E0、E1和E2蛋白组成,并具备良好免疫原性的病毒样颗粒BVDV-1 VLPs。     

携Apoptin和PEG3启动子双特异性溶瘤腺病毒对结直肠癌的抑制作用

目的： 探讨携带凋亡素基因（Apoptin）和进行性增量基因3（progression-elevated gene 3, PEG3）启动子的双特异性溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a对结直肠癌的体内、外抑制效果。方法： 以Ad-Apoptin-PEG3p-E1a、Ad-PEG3p-E1a、Ad-Apoptin、Ad-mock（均为前期工作构建）分别感染人结直肠癌SW1116细胞和胃黏膜上皮GES细胞,MTT法检测感染后细胞的增殖水平; 流式细胞术检测细胞的凋亡情况;采用DCFH-DA和Rho123染色流式细胞术分别检测细胞活性氧水平和线粒体膜电位,Western blotting检测细胞色素C的释放。建立BALB/c小鼠结直肠癌CT26细胞皮下移植瘤模型,观察Ad-Apoptin-PEG3p-E1a对结直肠癌皮下移植瘤的抑制作用。结果： Ad-Apoptin-PEG3p-E1a抑制SW1116细胞增殖,并具有一定的剂效和时效关系,以MOI=100感染72 h后抑制率达到（56.23±664）%,其抑制能力明显强于Ad-pEG3p-E1a和Ad-Apoptin等对照组（均P<0.05)。Ad-Apoptin-PEG3p-E1a感染导致SW1116细胞活性氧水平上调、线粒体膜电位下降以及细胞色素C释放增加,最终诱导SW1116细胞凋亡,凋亡率为（37.97±3.78）%,但对正常GES细胞的上述各项指标均无明显影响。Ad-Apoptin-PEG3p-E1a能显著抑制小鼠皮下移植瘤生长（P<0.05）;有效延长模型动物平均生存期,Ad-Apoptin-PEG3p-E1a治疗组平均生存期为（41.0±0.7）d,显著高于Ad-PEG3p-E1a的（34.4±1.6）d、Ad-Apoptin的（33.2±1.2）d和Ad-mock的（28.4±14）d （均P<0.05）。结论： Ad-Apoptin-PEG3p-E1a可以特异性有效抑制结直肠癌细胞增殖及皮下移植瘤的生长。     

Ad-apoptin通过AMPK/ACC信号通路抑制肺癌细胞脂代谢北大核心CSCD

目的:探讨溶瘤腺病毒Ad-apoptin对非小细胞肺癌细胞脂代谢的影响及分子机制。方法:CCK-8法检测细胞活性;JC-1染色和Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡;Western blot检测脂代谢和凋亡相关蛋白;siRNA干扰肺癌细胞AMPK的表达;Co-IP检测Ad-apoptin与AMPK蛋白相互间作用;建立移植瘤小鼠模型,检测肿瘤的生长,并通过免疫组化检测TUNEL、Ki-67、p-AMPK和FASN蛋白表达量。结果:Ad-apoptin对肺癌细胞抑制率具有浓度依赖性(P<0.05),显著诱导细胞凋亡(P<0.05),降低细胞脂质累积,下调三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)含量,上调p-AMPK和p-ACC;敲低AMPK可显著减弱Ad-apoptin诱导的凋亡,而抑制ACC可显著增强Ad-apoptin诱导的凋亡。在体内试验中,Ad-apoptin能抑制体内肿瘤生长,同时也能抑制细胞增殖,并促进细胞凋亡。结论:Ad-apoptin以AMPK为靶点,通过AMPK/ACC途径,抑制肿瘤增殖和脂代谢并促进细胞凋亡。     

新补骨脂异黄酮通过caspase-3/GSDME通路诱导肝细胞癌Huh-7细胞焦亡

目的：探讨新补骨脂异黄酮（NBIF）对肝细胞癌（HCC）Huh-7细胞焦亡的影响及其分子机制。方法：体外培养Huh-7细胞,用CCK-8法检测不同浓度的NBIF处理48 h时对细胞存活率的影响,光学显微镜下观察NBIF处理后Huh-7细胞的形态变化,乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测细胞的LDH释放量,WB实验检测细胞中GSDME、caspase-3的蛋白水平变化。采用si RNA干扰Huh-7细胞中caspase-3、GSDME表达后,CCK-8法检测NBIF处理对细胞存活率的影响,WB实验检测GSDME蛋白表达水平,观察NBIF处理对细胞形态的影响,并检测细胞LDH释放量。结果：60μmol/L以上的NBIF均能显著抑制Huh-7细胞的增殖（均P<0.01）,光学显微镜下观察到NBIF处理后的细胞出现肿胀、吐泡现象,且LDH释放增加（P<0.01）;WB实验结果表明,NBIF能够激活caspase-3蛋白并切割GSDME蛋白,增加GSDME-N的表达（均P<0.01）。干扰caspase-3、GSDME表达后,NBIF对细胞的抑制作用减弱（均P<0.01）,G...     

特异性溶瘤腺病毒调控肺癌细胞表达PD-L1及诱导凋亡的研究

目的:探究特异性溶瘤腺病毒(Ad-Mock、Ad-T)对肺癌细胞上PD-L1表达的调控作用及对细胞凋亡的影响.方法:采用荧光定量PCR法及Western blot检测溶瘤腺病毒在24 h和48 h对NCI-H446、NCI-H226、A549细胞表达PD-L1的影响;通过结晶紫染色、WST-1、Hoechst与JC-1...     

重组溶瘤腺病毒对荧光素酶标记和非标记人肺癌A549 细胞抑制作用比较

目的:探讨重组溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1A(ATV)对荧光素酶标记人肺癌细胞（A549-luc）和人肺癌细胞（A549）的体外抑制作用差异。方法：利用ATV分别感染A549 细胞和A549-luc 细胞,通过WST-1 和结晶紫染色法确定ATV的抑制作用的差异性,通过Hoechst 和Annexin V-FITC/PI 染色验证ATV的抑制方式。结果：ATV对A549 和A549-luc 细胞均具有明显抑制作用（P<0.05）。ATV在24、48、72 h 对两种细胞均有明显抑制作用（P<0.05 或P<0.01）,且72 h 抑制率最强;剂量分别为1、10 和100 MOI的ATV对两种细胞均有抑制作用,且100 MOI抑制率最高。A549 细胞和A549-luc 细胞感染ATV后,均呈现核碎裂典型浓染和边集的凋亡现象,且凋亡率随时间的增加而增大,具有显著的时间效应（P<0.05 或P<0.01）,且凋亡率均在72 h 达到峰值。结论：荧光素酶的插入没有明显改变ATV对A549-luc 细胞的抑制作用和抑制方式,ATV是通过诱导A549-luc 细胞和A549细胞凋亡从而达到对其显著性体外抑制作用.     

光甘草定对肺腺癌A549细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制

目的：探讨光甘草定对肺腺癌细胞A549 恶性生物学行的影响及其分子机制。方法：常规方法培养A549 细胞和人正常肺上皮细胞BEAS-2B,用不同浓度的光甘草定和或顺铂对其进行处理,通过结晶紫染色、CCK-8 法检测光甘草定、顺铂对A549、BEAS-2B细胞增殖活力的影响,Transwell 小室实验、细胞划痕实验检测光甘草定对A549 细胞侵袭、迁移能力的影响,流式细胞术检测光甘草定对A549 细胞凋亡的影响,3D超低黏附板培养法培养A549 细胞后采用CCK-8法检测光甘草定对A549 细胞增殖的影响,WB法检测光甘草定对A549 细胞中上皮间质转化（EMT）相关蛋白表达的影响;构建A549 细胞移植瘤模型后检测光甘草定、顺铂对移植瘤的生长以及移植瘤组织中EMT相关蛋白表达的影响。结果：光甘草定、顺铂呈剂量依赖性地显著抑制A549 细胞的增殖（P<0.05 或P<0.01）、细胞迁移（P<0.05 或P<0.01）和侵袭能力（P<0.05 或P<0.01）,光甘草定能诱导A549 细胞凋亡（P<0.01）,抑制A549 细胞中N-cadherin、snail 和vimentin 蛋白的表达,促进E-cadherin 蛋白表达;光甘草定、顺铂均能抑制A549移植瘤的生长,抑制移植瘤组织中Ki67、N-cadherin、snail 和vimentin 蛋白的表达、促进E-cadherin 蛋白的表达。结论：光甘草定可通过抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导A549细胞凋亡,其机制可能与其抑制细胞的EMT进程而产生抑癌作用有关。     

双特异性溶瘤腺病毒和多柔比星对乳腺癌细胞增殖抑制作用的对比分析

目的:探讨多柔比星和双特异性溶瘤腺病毒（Ad-VT、Ad-T、Ad-VP3、Ad-Mock）对乳腺癌细胞和正常乳腺细胞增殖抑制作用的差异。方法：通过WST-1 实验比较多柔比星和Ad-VT、Ad-T、Ad-VP3、Ad-Mock对乳腺癌细胞增殖的抑制率,并比较两种药物对正常乳腺上皮细胞的存活率的影响。通过Annexin V流式术、Hoechst 法、JC-1 法检测研究溶瘤腺病毒和多柔比星对乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞杀伤作用的影响,并比较其凋亡率差异。结果：4 种双特异性溶瘤腺病毒均能有效地抑制乳腺癌细胞的增殖（P<0.05 或P<0.01）,且抑制效果为Ad-VT>Ad-T>Ad-VP3>Ad-MOCK,抑制作用与时间成正相关。多柔比星也能有效地抑制乳腺癌细胞的增殖（P<0.05 或P<0.01）,且随着浓度和时间的增加,抑制效果明显增强;但多柔比星对正常的乳腺上皮细胞也有较强的抑制作用,在72 h、5 μg/ml 条件下抑制率达到80%,而溶瘤腺病毒Ad-VT在72 h 对MCF-10A的抑制率为20%。双特异性溶瘤腺病毒诱导乳腺癌凋亡能力随时间的增加逐渐增强（P<0.05 或P<0.01）,且致凋亡效率为Ad-VT>Ad-T>Ad-VP3>Ad-MOCK,而诱导正常乳腺细胞凋亡能力较弱。多柔比星诱导乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞凋亡的能力基本相同（P<0.05 或P<0.01）,且都为0.05<0.5<5 μg/ml。结论：双特异性溶瘤腺病毒能有效地抑制乳腺癌细胞的增殖,但对正常的乳腺细胞抑制作用较小,双特异性溶瘤腺病毒具有更好的安全性,为肿瘤的生物治疗提供了新的药物。