线粒体基因突变糖尿病的临床基因诊断技术

目的：了解线粒体基因突变在我国2型糖尿病（DM）人群中的存在情况，并为建立一种简便，快速的线粒体基因突变糖尿病的诊断方法提供基础。方法：采用PCR－RFLP方法对随机抽取的无亲缘关系的178例2型DM患者和150例健康对照的线粒体DNA突变热点区域tRNALeu(UUR)基因及其邻近区域内（nt2995-3494)4个位点，即nt3243,3316,3394,3426进行突变筛查。结果：在178例2例DM患者中发现5例nt3316G→A突变；对照组中未检出任何突变（P＜0．05），nt3316G→A突变频率为2．81％，突变使非极性的丙氨酸被极性的苏氨酸所取代（GCC→ACC），结论：nt3316G→A突变可能是2型糖尿病的易感因素之一，该方法简便易行，具有较高的特异性和敏感性，为线粒体基因突变糖尿病的临床诊断及群体筛查提供了基础。     

RNAi抑制PI3Kp85α蛋白活性对人乳腺癌细胞系MCF-7生长抑制的体外研究

目的:探讨敲低PI3Kp85α表达对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞生长的影响和机制.方法:用靶向PI3Kp85α的siRNA转染人乳腺癌细胞系MCF-7,使用Real-time PCR法鉴定转染PI3Kp85α表达水平;MTT法评价PI3Kp85α siRNA对乳腺癌细胞系MCF-7生长的影响;流式细胞术检测转染后细胞周期分布和凋亡;采用免疫荧光染色及Western blot方法观察IA型PI3K/AKT通路主要成员的表达.结果:Real-timePCR结果显示PI3Kp85α siR-NA转染导致PI3Kp85α表达下调;MTT结果显示PI3Kp85α siRNA转染抑制肿瘤细胞生长;流式细胞术检测可见PI3Kp85α siRNA转染组细胞周期存在G_0/G_1期阻滞而且凋亡率显著高于对照组与空载体组(F=19.255,P=0.002).结论:应用PI3Kp85α siRNA转染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞,可抑制其增殖和诱导细胞凋亡,因此PI3Kp85α可以作为人乳腺癌基因治疗的候选靶点.     

聚酰胺-氨纳米微粒介导5-氟尿嘧啶联合小RNA-21抑制乳腺癌细胞生长的研究

Objective To study the effect of PAMAM-mediated 5-fluorouracil combined with miR-21 inhibitor gene therapy to suppress MCF-7 human breast cancer cell growth in vitro. Methods 5-Fu/PAMAM complex was prepared by dialysis method and then incubated with miR-21 inhibitor at room temperature. Transmission electronic microscopy (TEM) was performed to observe the morphology of the nanoparticles. The drug loading efficiency and encapsulation efficiency was determined by ultraviolet spectroscopy (UV). The transfection of PAMAM dendrimer was detected by flow cytometry. MTT assay was carried out to determine MCF-7 cell growth survival rate. Cell apoptosis was analyzed by flow-cytometry. Transwell assay was performed to detect invasion ability after MCF-7 cells treated with 5-Fu chemotherapy combined with miR-21 inhibitor gene therapy. Results The morphology of the complex was sphere observed under TEM. Encapsulation efficiency and loading efficiency of drug were (66. 21±4. 11)% and (31.77±0. 73)% , respectively. Flow cytometry revealed that 5-Fu/PAMAM transfection efficiency was (60.54 ±6. 97)%. 5-Fu combined with miR-21 inhibitor treatment significantly suppressed cell growth, and the survival rate was only (55. 85±3. 71)% on the 6th day of the observation period. The apoptosis rate in combined treatment group was (18. 32±2.42)% , dramatically higher than in control group (F=58. 326,P<0. 01). In combined treatment group, the number of invasion cells was only 18. 96 ±3. 14, suggesting the greatly decreased invasion ability of MCF-7 cells (F=16. 409,P < 0. 01). Conclusion PAMAM could effectively deliver miR-21 inhibitor and 5-Fu simultaneously, and combined therapy can suppress growth of MCF-7 cells effectively in vitro.     

反义miR-221/222上调p27kip1对MCF-7乳腺癌细胞系的放射增敏作用

目的探讨敲低miR-221／222表达上调p27^kip1对MCF-7人乳腺癌细胞系放射敏感性的影响。方法经生物信息学分析查询miR-221／222成熟体序列和它们与p27^kip1的关系。脂质体共转染反义寡聚核苷酸（反义miR-221／222）后，用Northern blot法检测转染后MCF-7细胞miR-221、miR-222表达水平；将实验细胞分为6组：对照组、对照照射组、无义序列组、无义序列照射组、反义miR-221／222共转染组和反义miR-221／222共转染照射组。用MTT法检测细胞增殖及放射协同作用，流式细胞仪分析细胞周期，克隆形成实验检测细胞增殖，Western blot分析p27^kip1蛋白的表达变化。数据间的方差分析采用F检验；两两比较采用LSD-t检验。结果经生物信息学分析显示miR-221／222成熟体序列的种子序列几乎一致，p27^kip1是miR-221／222的靶基因。Northern blot显示反义miR-221／222共转染组miR-221、miR-222的表达水平明显下降（miR-221：P=0．000；miR-222：P=0．000）。对照组及无义序列组之间miR-221、miR-222表达水平的差异无统计学意义（miR-221：P=0．371；miR-222：P=0．284）。MTT结果显示转染后第4天共转染组肿瘤细胞生长抑制效果最好，细胞增殖率明显低于对照组和无义序列组（P=0．000），但与放射治疗无协同作用（P=0．091）。流式细胞术检测可见共转染组细胞周期存在G0／G1期阻滞（P=0．000）。经放射治疗后，可明显降低S期比例（P=0．002）。克隆形成实验表明反义miR-221／222可增加MCF-7细胞的放射敏感性。Western blot显示反义miR-221／222共转染组的p27^kip1蛋白表达明显上调（P=0．000）。结论反义miR-221／222通过上调p27^kip1蛋白表达可以增加MCF-7人乳腺癌细胞系放射敏感性。     

RNAi下调AKT1、PI3K P85表达抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖

目的：探讨RNAi（RNA interference）技术抑制乳腺癌MCF7细胞中AKT1和PI3K P85亚基的表达对MCF7细胞增殖和侵袭等的影响。方法：将包含AKT1、PI3K P85两种siRNA开放阅读框的短发夹RNA（shRNA）重组腺病毒质粒表达载体rAd5siAKT1siPI3K转染至乳腺癌MCF7细胞。应用realtime PCR和Western blotting检测转染后目的基因mRNA和蛋白的表达水平，并用Western blotting检测目的基因被沉默后PCNA、cyclin D1和P53的表达情况。应用MTT法、流式细胞术、2D和3D Matrigel实验检测MCF7细胞转染前后的细胞增殖周期和侵袭能力。结果：重组腺病毒质粒表达载体rAd5siAKT1siPI3K介导的靶向〖STBX〗AKT1, PI3K P85 shRNA可以有效抑制目的基因AKT1和PI3 Kp85的mRNA和蛋白表达；下游相关因子PCNA、cyclin D1的表达亦下调，P53表达则上调。MTT法结果显示rAd5siAKT1siPI3K组细胞生长抑制率>50%，与未转染组和rAd5siCtrl转染组比较，出现明显的G1/G0细胞周期阻滞；2D和3D Matrigel实验显示，未转染组和rAd5siCtrl转染组细胞呈正常形态，而rAd5siAKT1siPI3K 转染组细胞贴壁生长能力明显减低，细胞团块明显缩小。结论：靶向AKT1、PI3K P85亚基的shRNA技术可以抑制MCF7细胞中AKT1、PI3K P85亚基的表达，抑制MCF7细胞的体外增殖。     

大鼠脑组织中儿茶酚胺类神经递质的rP—HPLC—ECD定量分析

目的：建立一种定量分析脑组织中儿茶酚胺类神经递质的方法。方法：采用反相高效液相色谱电化学色谱法（ｒＰ－ＨＰＬＣ－ＥＣＤ）测定大鼠脑组织中去甲肾上腺素（ＮＥ）、肾上腺素（Ｅ）、多巴胺（ＤＡ）、５羟色胺（５－ＨＴ）。结果：由色谱图显示各单胺类成分分离完全。结论：本方法快速、简便、准确，为医务工作者提供方便与帮助     

测定HbA1c在鉴别急性脑梗死患者血糖升高性质中的意义

急性脑梗死患者常因应激反应或伴有糖尿病引起血糖升高,临床上及时诊断高血糖的原因对患者的治疗及预后具有重要价值,但急性期对这两种情况的鉴别存在一定困难。１９９４年３月～１９９７年１２月,我们在先前采用微柱层析法测定糖化血红蛋白（简称ＧＨｂ或ＨｂＡ１）的...     

大鼠脑组织中氨基酸类神经递质的rP-HPLC-UV柱前衍生定量分析

目的：测定大鼠脑组织中纹状体、海马、皮质中氨基酸的含量，研究中枢神经系统及脑能量代谢和某些疾病之间的关系。方法：用反相高效液相色谱法测定脑组织中的８种游离氨基酸，以２，４－二硝基氟苯（ＤＮＦＢ）作为衍生剂，在ＵＶ３６０ｎｍ进行测定，以外标法进行计算。结果：在２０ｍｉｎ内分出８种氨基酸，分离完全，且纹状体氨基酸含量高于海马和皮质。结论：本方法简便，灵敏度高，分析时间短，适用于一般实验室。     

聚酰胺-氨纳米微粒介导5-氟尿嘧啶联合小RNA-21抑制乳腺癌细胞生长的研究

目的 观察聚酰胺-氨(PAMAM)纳米微粒介导5-氟尿嘧啶(5-Fu)联合小RNA-21抑制乳腺癌细胞MCF-7生长的效果.方法 透析法制备5-Fu/PAMAM,孵育法同载miR-21抑制剂;透射电镜观察形貌;紫外分光光度计检测载药率和包封率;流式细胞仪检测转染效率及细胞凋亡;噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖;Transwell检测细胞侵袭能力变化.结果 5-Fu/PAMAM形貌规整,包封率为(66.21±4.11)%,载药率为(31.77±0.73)%,转染效率为(60.54±6.97)%;联合治疗组肿瘤细胞生长缓慢,在观察截止期时生存率(55.85±3.71)%;联合治疗组细胞凋亡率(18.32±2.42)%,与对照组比较明显增多(F=58.326,P<0.01);联合治疗组视野内细胞数目仅为(18.96±3.14)个,侵袭能力显著降低(F=16.409,P<0.01).结论 PAMAM可以实现5-Fu和miR-21的同载,并有效抑制乳腺癌细胞的体外生长.