黄连NRAMP3基因的克隆与生物信息学分析＊

目的 克隆黄连（Coptis chinensis Franch.）中自然抗性相关巨噬细胞蛋白（Natural Resistance-Associated Macrophage Protein，NRAMP）的编码基因，并进行生物信息学分析。方法 从黄连基因组中比对NRAMP3基因，并根据比对的基因序列设计特异性引物，经PCR扩增得到的黄连NRAMP3编码序列，进行克隆、测序和生物信息学分析，并利用qPCR技术对黄连NRAMP3基因进行时空表达分析。结果 得到黄连NRAMP3基因cDNA序列，全长1617 bp，编码538个氨基酸，通过与GenBank上的其他蛋白序列比对，将其命名为CcNRAMP3；序列分析显示，黄连NRAMP3基因编码的氨基酸序列包含一个典型的NRAMP结构域（PF01566），有12个跨膜结构域，亚细胞定位于液泡膜上，具有疏水性强的特点。二级结构中肽链构象主要包括α-螺旋与无规则卷曲两部分；三级结构模型具有葡萄球菌锰转运突变体（MntH）的晶体结构。利用系统进化关系分析推测它可能具有转运重金属元素Cd功能。对黄连NRAMP3基因的组织表达分析表明，CcNRAMP3基因在黄连叶片中表达量最高。在遭受镉胁迫时，在须根中表达量先升高后降低，该基因很可能主要在根部对镉进行响应并发挥作用。结论 本研究首次通过克隆得到黄连NRAMP3基因，并运用生物信息学方法对其理化性质、结构特征等进行了分析预测，这些结果将为黄连NRAMP3基因的功能研究以及其对镉转运的调控机制提供理论依据和基因资源。     

黄连解毒汤对Aβ1-42诱导AD大鼠学习记忆能力及胆碱能系统的影响

目的 探讨黄连解毒汤对β-淀粉样蛋白（Aβ）_1-42诱导阿尔茨海默病（AD）模型大鼠学习记忆能力和胆碱能系统的影响。方法 选用60只雄性SD大鼠，分为正常组，模型组，石杉碱甲组（2.1×10^-5 g·kg^-1），黄连解毒汤高、中、低剂量组（6，3，1.5 g·kg^-1）。运用Aβ_1-42海马注射复制AD大鼠模型，术后连续灌胃治疗4周，进行Morris水迷宫实验。苏木素-伊红（HE）染色观察大鼠海马病理改变，腹主动脉取血，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测大鼠血清、海马中乙酰胆碱（ACh），乙酰胆碱酯酶（AchE），胆碱乙酰转移酶（ChAT）含量；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测海马α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）蛋白表达；实时荧光定量聚合酶链式反应法（Real-time PCR）检测海马α7nAChR mRNA表达。结果 与正常组比较，模型组动物脑组织皮质区神经元坏死、海马区锥体细胞或颗粒细胞坏死、排列紊乱和炎性细胞浸润等病理改变明显，大鼠逃避潜伏期延长、逃逸平台次数降低、有效区域停留时间、有效区域游泳路径均减少（P<0.05，P<0.01），血清中ACh，ChAT浓度降低（P<0.01），海马中ACh，AchE，ChAT含量，α7nAChR蛋白，α7nAChR mRNA表达降低（P<0.01）；与模型组比较，黄连解毒汤中剂量组逃避潜伏期变短（P<0.05），逃逸平台次数、有效区域游泳路径、有效区域停留时间增加（P<0.05，P<0.01），血清ACh，ChAT含量和海马AchE，ChAT，α7nAChR mRNA表达上升（P<0.05），海马α7nAChR蛋白表达升高明显（P<0.01）；高剂量组有效区域有效区域停留时间延长（P<0.01）；逃逸平台次数增加，血清ACh，ChAT含量和海马ACh，AchE，α7nAChR蛋白，α7nAChR mRNA表达上升（P<0.05）。结论 黄连解毒汤可显著改善Aβ_1-42诱导AD大鼠学习记忆能力，其作用机制可能与改善Aβ_1-42所导致的胆碱能系统损伤，增强胆碱能系统功能有关。     

基于网络药理学研究黄连解毒汤抗幽门螺杆菌感染作用机制

目的运用网络药理学方法预测黄连解毒汤抗Hp感染的主要有效成分、靶点及信号通路,挖掘其潜在作用机制,为后续实验研究提供依据。方法应用TCMSP筛选黄连解毒汤中黄连、黄芩、黄柏、栀子4味中药的主要有效成分及其潜在作用靶点。通过GeneCards数据库和人类孟德尔遗传数据库(OMIM)筛选Hp感染相关靶点,并取药物和疾病的交集靶点。将交集靶点导入Cytoscape 3.7.2构建有效成分和Hp感染相关靶点网络,并进行拓扑学分析。应用STRING在线分析平台构建靶蛋白相互作用(PPI)网络并进行分析。运用R语言在线检索Bioconductor平台对靶点进行GO功能富集;通过DAVID数据库对靶点进行KEGG通路富集分析。结果黄连解毒汤中共筛选出85个有效成分,主要包括槲皮素、小檗碱、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素等。对应靶点112个,疾病相关靶点1960个,药物疾病共同靶点71个。网络中度值最高的有效成分为槲皮素,度值最高的靶点为环加氧酶1(PTGS1)。PPI网络中69个节点中度值较高的靶蛋白包括半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、IL6、MAPK8、原癌基因(MYC)、VEGFA、表皮生长因子受体(EGFR)等。GO功能富集分析共获得89个条目,KEGG通路富集分析共筛选12条存在显著差异的信号通路,其中发挥主要作用的有癌症通路、ErbB信号通路、p53信号通路、凋亡、黏附斑等。结论黄连解毒汤可通过多成分、多靶点、多通路发挥对Hp的治疗作用,可通过抗肿瘤机制调控胃癌进程,本研究可为其有效成分研究和抗Hp机制研究提供依据。     

黄连不同方法提取物治疗2型糖尿病大鼠的比较研究

目的比较黄连不同方法提取物中有效成分的含量及其对2型糖尿病大鼠的治疗效果,探讨其主要成分含量与其疗效的相关性。方法①高效液相色谱法(HPLC)测定黄连超临界萃取物及黄连模拟胃液提取物中代表性有效成分的含量;②90只成年雄性Wistar大鼠作为研究对象,随机抽取15只作为正常对照组(N组),予以标准鼠饲料喂养,其余大鼠予以高脂饲料喂养联合尾静脉注射小剂量链脲佐菌素(STZ)建立2型糖尿病大鼠模型,造模成功后随机分为模型对照组(M组)、阳性对照组(D组)、黄连超临界萃取物治疗组(A组)和黄连模拟胃液提取物治疗组(B组);连续治疗9周后,比较各组大鼠的体重、OGTT血糖水平、血清三酰甘油(TG)及白介素-6(IL-6)水平以及肠道组织病理状态。结果①2种提取物在相同剂量时,黄连超临界萃取物中各代表性有效成分的含量均高于黄连模拟胃液提取物;2种提取物在有效剂量时,黄连超临界萃取物中仅小檗碱与巴马丁的含量高于黄连模拟胃液提取物;②以有效剂量治疗9周后,D组、A组、B组大鼠OGTT血糖水平、体重、血清TG及IL-6水平均明显低于M组大鼠(P0.05);A组与B组比较,差异无统计学意义(P0.05);光镜下,D组、A组、B组大鼠肠道组织石蜡切片HE染色显示炎性改善均显著优于M组。结论黄连超临界萃取物及黄连模拟胃液提取物对2型糖尿病大鼠均有一定的治疗作用,可显著降低血糖、血脂、体重及血清IL-6水平,改善肠道慢性炎症,其主要成分含量与其疗效无相关性。     

黄连温胆汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎临床观察

目的观察黄连温胆汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎Hp根除的临床疗效。方法选择接收的Hp感染慢性浅表性胃炎患者82例,纳入时间为2017年2月—2018年7月,采用随机数字表法将其分为实验组与对照组,每组均41例。对照组采用西药四联治疗,试验组行黄连温胆汤与四联联合治疗,对比2组患者症状积分、不良反应及Hp根除率。结果试验组胃脘胀痛、腹胀满、口苦、恶心呕吐、胃脘灼热、尿黄、口臭等症状积分均低于对照组,差异明显(P 0. 05)。2组患者便秘、腹泻、皮疹等不良反应发生率(9. 76%、7. 32%)未见明显差异(P 0. 05)。试验组Hp根除率(87. 80%)明显高于对照组(65. 85%),差异有统计学意义(P 0. 05)。结论幽门螺杆菌感染所致慢性浅表性胃炎患者采用黄连温胆汤治疗效果显著,其安全性水平较高,应予以临床推广。     

黄连木香配伍治疗溃疡性结肠炎临床疗效及机制研究

目的:通过治疗溃疡性结肠炎患者,探究黄连配伍木香治疗的临床疗效与机制,并观察临床治疗有效率、生活质量改善、血清抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)含量变化、结肠黏膜组织Smad7表达水平变化、结肠黏膜组织转录调节因子ⅠκBα表达水平变化。方法:采用随机对照方法收集2015年11月—2018年4月期间于我院肛肠科诊治的溃疡性结肠炎病例患者120例,采用随机数表法将其随机分成对照、观察两组,各60例患者。对照组患者采用5-氨基水杨酸口服联合5-ASA灌肠液治疗;观察组在对照组治疗基础上联合应用黄连、木香方剂进行治疗,治疗2个月后观察临床治疗有效率、生活质量改善,以及血清抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)含量变化、结肠黏膜组织Smad7表达水平变化、结肠黏膜组织转录调节因子ⅠκBα表达水平变化。结果:观察组中医证候治疗总有效率(86.7%)显著高于对照组(63.3%)(P0.05),观察组治疗后临床疗效率(61.7%)、肠镜疗效率(90.0%)均显著高于对照组(35.0%、40.0%)(P0.05),差异具有统计学意义(P0.05),提示黄连、木香方剂可明显提高疗效;与治疗前比较,两组IBDQ量表评分均显著提高(P0.05),组间比较观察组提高明显,差异显著(P0.05);治疗后两组患者Smad7表达水平均下降明显,组内及组间比较差异均具有统计学意义(P0.05);治疗后两组患者ⅠκBα表达水平均下降,组内及组间比较差异均具有统计学意义(P0.05);治疗后两组患者ANCA阳性率均下降明显,组内及组间比较差异均具有统计学意义(P0.05)。结论:在常规西药治疗基础上联合应用黄连、木香中药治疗慢性溃疡性结肠炎患者可取得满意的临床综合疗效,显著改善生活质量,促进中医症状改善,在缓解腹泻、腹痛症状方面,溃疡性结肠炎患者采用黄连、木香治疗具有显著优势,应在临床中广泛应用。     

八味黄连跌打水联合手法治疗肩周炎临床研究

目的:观察八味黄连跌打水联合手法治疗肩周炎的临床疗效及可行性。方法:将收治的156例肩周炎患者按照随机数字表法分为2组各78例。观察组及对照组均给予常规推拿手法治疗,观察组在以上治疗基础上给予八味黄连跌打水外敷治疗。治疗后比较2组关节活动度(ROM)评分、疼痛视觉模拟评分法(VAS)评分及临床疗效,并对观察组进行辨证分型,观察各证型疗效。结果:临床疗效观察组总有效率98.7%,对照组83.3%,差异有统计学意义(P 0.05);观察组ROM评分高于对照组,VAS评分低于对照组,差异均有统计学意义(P 0.01)。观察组八味黄连跌打水联合手法治疗对湿热型肩周炎患者的疗效优于其他证型患者,差异均有统计学意义(P 0.01)。结论:八味黄连跌打水联合手法治疗肩周炎能提高临床疗效,对湿热型肩周炎患者疗效更佳。     

从心论治青春期后女性痤疮40例临床研究

目的:观察从心论治青春期后女性痤疮临床疗效及对患者生活质量和焦虑抑郁的影响。方法:80例青春期后女性痤疮患者,随机分为治疗组与对照组,每组40例。治疗组治以清心火、安心神,予中药饮片煎服;对照组予盐酸多西环素胶囊、螺内酯口服。2组疗程均为8周。观察并比较2组患者治疗前后皮损积分、痤疮特异性生活质量调查问卷(AcneQo L)和患者健康调查问卷-4(PHQ-4)评分变化,并比较临床疗效。结果:治疗后2组患者皮损积分、PHQ-4评分均较治疗前显著下降(P0.01),Acne-Qo L评分显著升高(P0.01);治疗组对于情感功能和PHQ-4评分的改善明显优于对照组(P0.05)。治疗组临床愈显率为85.0%,与对照组的82.5%相当,差异无统计学意义(P0.05)。结论:从心论治青春期后女性痤疮临床疗效确切,能提高患者的生活质量,与西药对照组相比,更能有效地改善患者情感功能及焦虑、抑郁情绪。     

黄连解毒汤改善自发性高血压大鼠的宏观表征和行为学

目的观察黄连解毒汤(HLJD)对自发性高血压大鼠(SHR)血压、宏观表征和行为学的影响。方法 40只SHR随机均分为模型组和HLJD (5.4 g·kg~(-1)·d~(-1))组,另取20只Wistar大鼠设为正常对照组,灌胃给药6周,于给药前和给药后1、 2、 4、 6周检测大鼠血压,观察大鼠宏观表征(活动、神情、毛发和大便状况)和行为学(易激惹程度、旋转耐受时间、热痛阈)改变。结果正常对照组给药前后无明显变化。与正常对照组比较,模型组血压逐渐升高(P <0.01),随着月龄增长大鼠毛发脱落、大便多稀溏、烦躁易怒等宏观表征更为明显。与模型组比较,在给药4周末,HLJD组血压显著降低(P <0.01),表现温和,毛发光泽,易激惹程度评分显著降低,旋转耐受时间延长(P <0.05),但热痛耐受时间无显著差异(P> 0.05)。结论 HLJD可降低SHR血压,改善宏观表征和行为学。