rhIFNα_(2a)、IFNα_(2b)和IFNα_(1b)、IFNα_(1b)突变体的抗病毒效应的对比分析

目的　进一步研究不同亚型不同品牌基因工程干扰素的抗病毒效应。方法　采用微量细胞病变 (CPE)抑制法进行抗病毒试验。结果　不同品牌IFNα2a或IFNα2b5 0 0、5 0、5IU/ml在Vero细胞上分别可抗 10 0 0、10 0、10TCID50 的Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒感染细胞 ;5 0 0、5 0、5IU/mlIFNα1b或IFNα1b突变体 ,在Vero细胞上分别也可抗8、4、2TCID50 的Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒感染细胞。结论　进口和国产不同品牌的IFNα2a或IFNα2b对上述 2种病毒具有同等抗病毒作用。IFNα1b突变体抗病毒效果和IFNα1b无明显差别。     

御寒暖胃膏穴位贴敷对胃癌前病变大鼠胃黏膜的影响

目的:研究御寒暖胃膏贴敷胃经穴对慢性萎缩性胃炎癌前病变大鼠胃黏膜的影响,探讨御寒暖胃膏贴敷胃经穴对慢性萎缩性胃炎癌前病变大鼠胃黏膜损伤修复的作用机制。方法:大鼠随机分为正常组、模型组、御寒暖胃膏贴敷胃经穴组、御寒暖胃膏贴敷对照点组、药物对照组,采用综合干预方法复制慢性萎缩性胃炎癌前病变大鼠模型,肉眼下观察大鼠胃黏膜损伤指数,光镜下观察胃黏膜组织的病理变化,彩色多普勒观察胃黏膜的血流量。结果:与模型组比较,御寒暖胃膏贴敷胃经穴组和药物对照组大鼠胃黏膜损伤指数值均显著降低(P0.05),胃黏膜组织的病理损伤得到明显修复,胃黏膜血流量均显著升高(P0.05);御寒暖胃膏贴敷对照点组大鼠胃黏膜损伤指数值未见明显降低(P0.05),胃黏膜组织的病理损伤未得到明显修复,胃黏膜血流量未见显著升高(P0.05)。结论:御寒暖胃膏贴敷胃经穴可以促进慢性萎缩性胃炎癌前病变大鼠胃黏膜损伤的修复,增加胃黏膜的血流量,并且存在经脉-脏腑特异相关性。     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达

目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上,构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165,经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。结果:PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒,PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后,病毒效价可达(2.0～5.0)×1010pfu/mL。转染48h后,293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高(F=427.93,17.93,P<0.05)。结论:成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒,血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

Ad-ING4对人前列腺癌细胞PC-3体内外抑癌效应的研究

背景与目的：腺病毒作为载体已被广泛用于肿瘤的基因治疗。ING4是生长抑制因子家族中的一个成员,是一种潜在的抑癌基因。本研究旨在探讨腺病毒介导的人ING4基因（Ad-ING4）对人前列腺癌细胞PC-3的体内外抑癌效应及其分子机制。方法：将扩增的Ad-ING4重组腺病毒感染PC-3细胞,用RT-PCR法检测ING4在PC-3细胞中的转录;MTT法检测ING4基因对PC-3细胞增殖的影响：流式细胞术和Hoechst33258染色法检测细胞凋亡的变化;半定量RT-PCR法检测ING4基因的表达对PC．3细胞中的bcl-2、bax、p53和caspase-3凋亡相关基因表达的影响。用Ad-ING4重组腺病毒在裸鼠PC-3移植瘤的瘤体内注射治疗,观察肿瘤生长变化,15d后处死裸鼠,摘除瘤体,称瘤重;用免疫组化法检测瘤组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3和CD34蛋白的表达。结果：腺病毒介导的人ING4基因在PC-3细胞中成功转录,明显抑制PC-3细胞增殖,上调p53、bax、caspase．3基因表达和下调bcI-2基因表达,并诱导细胞凋亡。Ad-ING4重组腺病毒能显著抑制裸鼠PC-3移植瘤的生长,瘤重的抑制率达37％,与空病毒载体Ad-GFP组和细胞对照PBS组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;免疫组化结果显示Ad-ING4重组腺病毒能明显上调Bax和Caspase-3蛋白的表达水平,下调Bcl-2和CD34蛋白的表达水平。结论：腺病毒介导的ING4基因在体内外均可明显抑制人前列腺癌细胞PC-3的生长,诱导其凋亡,其机制可能是上调P53、Bax、Caspase-3蛋白和下调Bcl-2蛋白表达水平。     

不同直径针具在压敏点恢刺法治疗颈源性头痛中的疗效差异分析

目的:观察不同直径针具对颈源性头痛患者简式McGill疼痛问卷评分、颈椎活动度、头痛改善率的影响,以评价其临床疗效,并观察其压敏点痛阈的变化情况。方法:将72例颈源性头痛患者随机分为治疗组和对照组各36例,治疗组采用直径0.45 mm的毫针行压敏点恢刺法,对照组采用直径0.30 mm的毫针行压敏点恢刺法,隔日治疗1次,每周治疗3次,共治疗2周。在治疗前及疗程结束后第2天,予简式McGill疼痛问卷评分、颈椎活动度评估及痛阈测定。结果:治疗组在改善患者简式McGill疼痛问卷评分、颈椎活动度和头痛改善率方面均优于对照组(P0.05);两组患者治疗后压敏点的痛阈均升高(P0.05);治疗组患者治疗后压敏点的痛阈高于对照组(P0.05)。结论:在压敏点恢刺法治疗颈源性头痛的针灸治疗中,粗针的临床疗效优于细针,其作用机制可能与松解粘连,缓解肌筋膜痉挛及纠正高位颈椎关节紊乱相关。     

重组人IL-18在大肠杆菌中的表达及其抗肿瘤作用

目的：获取rhIL-18原核表达产物并研究其活性。方法：用本室构建的含基因重组表达载体PBV220-IL-18的大肠杆菌DHSot，经42℃热诱导表达和包涵体提取纯化后获取rhIL-18蛋白；采用ELISA试剂盒检测rhIL-18刺激PBMC分泌IFN-γ的活性及MTT法检测其对NK细胞杀伤K562细胞自然杀伤活性；同时用荷瘤小鼠模型检测其体内抗瘤功能。结果：诱导含重组表达载体PBV220-IL-18的大肠杆菌D145ct后，蛋白电泳显示出一条相对分子量（Mτ）为18000的蛋白条带；10μg rhIL-18蛋白体外刺激PBMC后，其分泌IFN-γ的能力与对照组相比提高了8倍，细胞毒性提高3倍；同时rhIL-18蛋白能明显抑制肿瘤生长和延长荷瘤鼠生存期。结论：获得了有免疫调节功能和抗肿瘤活性的rhIL-18蛋白。为今后IL-18重组产物的研制和开展肿瘤的生物治疗提供了实验依据。     

人硫氧还蛋白基因克隆及其重组逆转录病毒载体的构建和鉴定

目的 克隆人硫氧还蛋白（hTRX）基因,并构建含有该目的 基因的重组逆转录病毒载体。方法 利用RT-PCR法,以PHA活化的人外周血单个核细胞总RNA为模板,扩增hTRX编码蛋白的cDNA基因,并亚克隆至逆转录病毒载体pSIV-1中进行PCR、双酶切和测序鉴定。结果 将所得的序列与GenBank（BC003377）报道的序列比较,其酶活性中心（Trp-Cys-Gly-Pro-Cys）与已知序列一致,第132、136、170、264位碱基与已知序列不同,其中第136、170位相应密码子编码的氨基酸发生了变化（Phe→Leu,Ile→Thr）,成功获得了pSIV-1-hTRX重组逆转录病毒载体。结论 hTRX基因的克隆及其重组逆转录病毒载体pSIV-1-hTRX的构建,为进一步探讨hTRX的生物学活性和应用奠定了基础。     

蚕丝蛋白材料对鼠胚表皮细胞毒性的实验研究

目的研究不同蚕丝蛋白材料对鼠胚表皮细袍的毒性及其影响细胞增殖的因素。方法采用组织块培养法体外原代培养鼠胚表皮细胞，用直接接触法和浸提液法体外培养鼠胚表皮细胞，MTT比色法检测其在不同蚕丝蛋白材料上的增殖活力和细胞相对增殖率，进行毒性分析；并用活细胞计数法观察不同蚕丝蛋白材料对鼠胚表皮细胞生长的影响。结果鼠胚表皮细胞在1、2、4、5、7、8、10号各型蚕丝蛋白材料上生长，其增殖活力与细胞对照组相当（P〉0.05）；在3、6、9号化学交联或HY-823交联型蚕丝蛋白材料上生长，其增殖活力均低于细胞对照组（P〈0．05）；而在11号蚕丝蛋白材料其增殖活力显著低于细胞对照组（P〈0．01）。1、7号丝胶材料细胞毒性分级为0级（无毒），2、3、4、5、6、8、9、10号各型蚕丝蛋白材料细胞毒性分级为1级（轻微毒），而11号蚕丝蛋白材料细胞毒性分级为2级（中度毒）。活细胞计数结果与MTT检测结果基本相一致。结论除11号蚕丝蛋白材料外，1～10号各型蚕丝蛋白材料无明显细胞毒性，能支持鼠胚表皮细胞正常生长，具有良好的细胞相容性。     

人IL-24基因在CHO细胞中的表达及其抗肿瘤效应

目的构建人IL-24基因真核表达载体,在CHO细胞中进行稳定表达,并检测重组表达蛋白rhIL-24的抗肿瘤活性。方法将测序验证的人IL-24基因亚克隆至真核表达载体pcDNA3,构建重组真核表达载体pcDNA3-hIL-24,转染CHO细胞进行稳定表达,经RT-PCR鉴定后用MTT法、Ho-echst染色和流式细胞术检测CHO细胞表达的rhIL-24诱导A549人肺腺癌细胞凋亡的抗肿瘤效应,用ELISA检测其刺激免疫细胞分泌IL-6和IFN-γ的功能。结果经双酶切和PCR鉴定,重组真核表达载体构建正确,人IL-24在CHO细胞中获得稳定表达,且所表达的人IL-24具有较强的诱导A549人肺腺癌细胞凋亡及上调免疫细胞表达IL-6和IFN-γ的免疫刺激活性。结论人IL-24基因的稳定表达和抗肿瘤效应的实验研究,为进一步研究人IL-24抗肿瘤的分子机制及潜在的应用奠定了基础。     

人白细胞介素-17F基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人白细胞介素-17F基因，并构建含有该目的基因的重组原核表达载体，获得高效表达hIL-17F的基因工程菌。方法 利用RT-PCR法，以PHA活化的人外周血单个核细胞的总RNA为模板，扩增出hIL-17FFeDNA的编码序列，并分别亚克隆至pUCm-T载体和原核表达载体pGEX．5X-3中，进行PCR、酶切鉴定和DNA序列测定。将重组原核表达载体转化感受态大肠杆菌B121后经IPTG诱导表达获得包涵体融合蛋白，且Western印迹鉴定。结果 PCR产物大小及其单酶切鉴定均证明所克隆的基因是hIL-17F，DNA序列测定进一步证实与GeneBank报道的序列完全一致。成功构建了重组原核表达载体pGEX-5X．3／hIL-17F，并在大肠杆菌中获得高效表达，约占菌体总蛋白的55％，且Western印迹证实确为目的蛋白。结论 该基因系国内首次克隆，hIL-17F基因重组体的构建和在大肠杆菌BL21中的高效表达，为进一步探讨其生物学活性和应用奠定了基础。