浙贝母黑斑病致病菌的分离鉴定及分子检测

[目的]分离、纯化和鉴定浙贝母黑斑病的病原真菌,为浙贝母黑斑病的监测及防治提供实验基础。[方法]采用患病组织分离法在马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基上分离纯化病原真菌,PCR扩增基因组DNA的核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)、翻译延伸因子-1α(translation elongation factor-1α,TEF-1α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,G3PDH)和RNA聚合酶Ⅱ亚基(the second largest subunit of the nuclear RNA polymerase enzymeⅡ,RPB2)序列并双向测序、拼接,与GenBank中序列同源性比对后构建系统发育树,确定真菌种类,以摩擦接种法检测致病性。[结果]从浙贝母黑斑病病株中分离纯化获得2种链格孢属真菌。分离物1的ITS、TEF-1α、G3PDH、RPB2扩增片段与GenBank中链格孢菌(登录号:MG182428、KY175227、XM018523704、MG250634)的同源性均为100%;分离物2则与细极链格孢菌(登录号:MK967997、LC136862、KY290574、LT707523)的同源性均为100%。经摩擦接种确定两种链格孢属真菌均为浙贝母黑斑病致病菌。[结论]浙贝母黑斑病的病原真菌有链格孢菌和细极链格孢菌,其中细极链格孢菌首次被证明可引起浙贝母黑斑病。     

浙贝母叶斑病病原真菌的分子鉴定及杀菌剂筛选

[目的] 明确浙贝母叶斑病的致病菌种类，并筛选有效杀菌剂。[方法] 采用病组织分离法，从浙贝母叶斑病病株中分离纯化真菌，以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增基因组DNA的内源转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)、翻译延伸因子-1a(translation elongation factor-1a，TEF-1a)和微管蛋白基因(tubulin gene，TUB)并双向测序，经DNAMAN 9.0软件拼接后利用基本局部对齐搜索工具(basic local alignment search tool，BLAST)进行分析。采用邻接法构建系统发育树以鉴定真菌种类，采用菌饼接种寄主植物和组培苗的柯赫氏法检测致病性，以生长速率法和抑菌圈法室内筛选病原真菌的有效杀菌剂。[结果] 从浙贝母叶斑病病株中分离纯化获得1种间座壳属(Diaporthe)真菌。分离物的ITS、TEF-1a和TUB扩增片段与GenBank中Diaporthe eres(无性型为Phomopsis oblonga，P. oblonga)相应片段的同源性分别为100%、99.73%和96.95%(登录号:LC342971、MW804672、MT561360)。在间座壳属中，分离物与P. oblonga的亲缘关系最近。该菌株接种浙贝母植株和组培苗后诱发浙贝母叶斑病。吡唑醚菌酯、咯菌腈、异菌脲、苯醚甲环唑、腈菌唑、咪鲜胺对该真菌的半最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect，EC50)分别为0.174、0.084、1.092、0.041、0.619和0.004 mg·mL-1；6种杀菌剂对P. oblonga孢子萌发的抑制效果为咪鲜胺>吡唑醚菌酯>苯醚甲环唑>腈菌唑>咯菌腈和异菌脲。[结论] 本研究证实，P. oblonga是浙贝母叶斑病病原真菌，咪鲜胺和苯醚甲环唑是防治浙贝母叶斑病的有效杀菌剂。