不同地理居群新塔花的ITS2和psbA-trnH序列及聚类分析

目的:分析18个不同地理居群新塔花的内转录间隔区(ITS)2和psbA-trnH序列,为其种质资源评价和基原药用植物遗传多样性分析提供参考。方法:试剂盒法提取新塔花基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增ITS2和psbA-trnH间隔区序列,双向测序,拼接,基于Kimura两参数模型(K2P)构建邻接法(NJ)系统发育树。结果:不同地理居群新塔花ITS2和psbA-trnH序列均有种内差异。ITS2序列长度平均为236 bp,检测有9个单倍型,遗传距离为0～0. 022,不同地理居群新塔花聚为两支,XTH3,XTH6,XTH9等10个地理居群聚为一支,XTH4,XTH5,XTH10等8个地理居群聚为另一支。除XTH6的psbAtrnH序列存在6 bp缺失外,其他地理居群的psbA-trnH序列长度均为355 bp,检测有4个单倍型,遗传距离为0～0. 023,不同地理居群新塔花聚为两支,XTH1,XTH3,XTH4等12个地理居群聚为一支,XTH14,XTH17,XTH18聚为另一支。基于ITS2+psbA-trnH组合序列的系统发育(NJ)树显示,不同地理居群的新塔花可分为两支,XTH11,XTH12,XTH16等12个地理居群聚为一支,XTH14,XTH17,XTH18聚为另一支。结论:不同地理居群的新塔花地理位置接近或相似,相对遗传距离较小,亲缘关系较为接近,说明不同地理居群新塔花的亲缘关系及其遗传多样性与地理位置相关。     

何首乌等位基因特异性PCR鉴别方法研究

目的建立一种快速鉴别何首乌真伪的方法。方法通过何首乌及其混伪品的psb A-trn H基因序列,寻找SNP位点并设计特异性引物,对来自于不同产地的何首乌及其3个同属混伪品进行PCR扩增,优化反应体系条件,并对此方法进行考察。结果建立了何首乌特异性PCR的方法,在退火温度48℃、循环次数30时仅有何首乌能扩增得到191 bp的特异性条带,伪品则无。结论等位基因特异性PCR鉴别何首乌真伪方法简单、可靠。     

中药材DNA条形码技术研究进展

摘 要 药用植物滥用现象带来的众多有害反应已经引起了国内外广泛的关注。药物安全使用问题亟待解决。DNA条形码是一种强有力的分子鉴定技术,它能弥补传统形态学和化学方法鉴定中药材的不足之处。近年,DNA条形码技术给中药材的鉴定带来了新的视野也获得了众多突出性成绩。一些热门的DNA条形码候选序列如ITS, ITS2, psbA-trnH, rbcL, matK已经用于中药材的鉴定。     

ITS2+psbA-trnH复合序列鉴定徐长卿、白薇和白前

目的：建立以ITS2+psbA-trnH复合序列鉴定徐长卿、白薇和白前及其同属近缘混伪品的DNA条形码鉴定方法。方法：搜集徐长卿、白薇、白前及其近源混伪品,采用改良的CTAB法提取DNA,通过实验分别获得ITS2和psbA-trnH序列,将同一样本的ITS2序列与psbA-trnH序列整合得到43条ITS2+psbA-trnH复合序列,从GenBank数据库中下载来源于同一样本的ITS2序列与psbA-trnH序列整合得到14条ITS2+psbA-trnH 网上复合序列,用MEGA 6.05软件分析徐长卿、白薇、白前及其近源混伪品的复合序列变异位点,计算种内、种间的K2P距离,并构建NJ系统聚类树。结果：徐长卿、白薇和白前药材ITS2+psbA-trnH复合序列比对后产生17个变异位点;徐长卿、白薇和白前基源物种种内最大K2P距离均小于其与混伪品的种间最小K2P距离;系统NJ树能准确将徐长卿白薇和白前及其近缘混伪品。结论：该研究建立了应用ITS2+psbA-trnH复合序列鉴定徐长卿、白薇、白前及其近缘混伪品的DNA条形码鉴定方法。     

探索psbA-trnH序列对竹茹、天竺黄及其近缘物种的鉴定

目的：采用psbA-trnH序列对竹茹、天竺黄及其近缘物种进行DNA条形码鉴定研究,保障临床用药准确、安全。方法：收集竹茹、天竺黄及其近缘物种共71份材料,提取基因组DNA、PCR扩增并双向测序,经CodonCode Aligner V 4.2拼接获得序列,应用MEGA5.0比对分析,计算种内及种间Kimura-2-Parameter（K2P）遗传距离并构建系统发育树。结果：竹茹、天竺黄各基原及其近缘物种基于psbA-trnH序列的种内最大K2P遗传距离均小于其与近缘物种的种间最小K2P遗传距离;NJ树图结合MEGA比对结果显示,基原植物青杆竹与青皮竹之间无法区分,而竹茹、天竺黄及其他基原物种之间均可较好地区分并呈现明显的单系性。结论：基于psbA-trnH序列可以准确地鉴定多基原药材竹茹、天竺黄及其近缘物种。     

基于叶绿体psbA-trnH基因间区序列鉴定肉苁蓉属植物

肉苁蓉的干燥肉质茎是常用中药材, 药典收录基源植物有管花肉苁蓉和荒漠肉苁蓉两种, 但是市场上经常会与黄花列当、草苁蓉、盐生肉苁蓉及沙苁蓉等混用。本文对不同类群肉苁蓉及混淆品的叶绿体psbA-trnH基因间区进行PCR扩增并测序, 获得了该区间的完整序列, 用K-2P法建立了系统进化树, 聚类结果与形态分类相符。所得结果显示, psbA-trnH片段序列在肉苁蓉及混淆品种间存在丰富的变异, 肉苁蓉属各种的种间遗传距离从0.077% 到0.743%, 种内遗传距离从0% 到0.007%, 种内和种间存在明显的“barcoding gap”。肉苁蓉属各种与黄花列当的遗传距离为0.979% 至1.149%, 与草苁蓉的遗传距离为1.066% 至1.224%。研究结果表明psbA-trnH基因间区可以作为条形码来鉴定肉苁蓉及其混淆品。     

基于杜娟属植物的DNA条形码序列筛选

我国的杜鹃属有毒植物约在60种以上，如羊踯躅等药用植物具有强毒付作用，而目前杜娟属的分类十分复杂。DNA barcoding技术是一种新的物种鉴定技术，COI序列已成功应用于动物的鉴定，但是目前国际上还没有找到一个通用序列能鉴定所有植物物种。本文对杜娟属257个物种ITS、ITS2、matK、PsbA—trnH序列比较，运用Wilcoxon秩和检验比较不同序列的变异性，然后用Taxon DNA软件评估这四个序列的barcodinggap。筛选适合于杜娟属的DNA条形码序列。分析结果表明：matK和psbA—trnH并不适合于杜娟属的DNA barcoding鉴定。ITS2和ITS序列都可以有效的对杜娟属植物进行DNA barcoding鉴定，但ITS在物种中的扩增效率较低，因此推荐将ITS2序列作为一个潜在的杜娟属植物DNA barcoding鉴定候选序列。     

基于ITS2和psbA-trnH序列鉴别金线兰及其近缘种

目的 应用ITS2和psbA-trnH条形码鉴定金线兰Anoectochilus roxburghii及其近缘种。方法 提取金线兰及其近缘种的DNA,对ITS2和psbA-trnH序列进行扩增和测序,计算物种种内、种间遗传距离,构建邻接法（neighbor-joining,NJ）系统聚类树直观反映鉴定结果。结果 经PCR扩增后测序,金线兰及其近缘种ITS2序列长度为250～254 bp,GC含量为48.2%～51.6%;psbA-trnH序列长度为636～704 bp,GC含量为31.8%～32.0%。根据K2P遗传距离计算,金线兰的种内遗传距离明显小于种间遗传距离。基于ITS2序列构建的NJ树结果显示,除长片金线兰A.longilobus外,金线兰与其余混伪品可以明显区分。基于psb A-trnH序列构建的NJ树结果显示,除长片金线兰和丽蕾金线兰A.lylei外,金线兰与其余金线兰属近缘种可以明显区分。结论 ITS2和psb A-trnH序列可以鉴别金线兰与其遗传距离较远的近缘种。     

蕨类药材石韦及其混伪品的psbA-trnH序列鉴定

为考察psbA-trnH序列鉴定蕨类药材的可行性,该研究以蕨类药材石韦及其混伪品作为研究对象,对其106份样品提取基因组DNA,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增其叶绿体psbA-trnH序列,并采用Mega6.0软件进行多序列比对,计算种内及种间K2P遗传距离,采用最大似然法（ML）构建系统聚类树。结果表明：石韦药材3个基原植物的psbA-trnH序列种内最大遗传距离均小于其与混伪品的种间最小遗传距离;ML树显示石韦药材可与其混伪品明显分开;psbA-trnH序列可作为蕨类药材的DNA条形码,能准确、稳定鉴定蕨类药材石韦及其混伪品。     

应用DNA条形码技术对市场苦木药材的检测研究

利用DNA条形码技术对市场上中药材苦木进行检测,为其市场监管及用药安全提供保障。方法：对15份苦木药材（每份取样2个）共30个样品进行DNA提取,PCR扩增其ITS2序列并双向测序,应用CodonCode Aligner version 6.0.2软件对测序峰图进行校对拼接,将得到的所有序列与GenBank以及中药材DNA条形码鉴定系统分别进行比对,选择相似度最相近的物种在中国植物志网站上查询。在此基础上扩增其psbA-trnH 序列以验证结果的可靠性。结果：市场购买的苦木样品中正品苦木Picrasma quassioides 占70%、臭椿Ailanthus altissima占6.67%、板蓝Baphicacanthus cusia占13.33%、楝叶吴茱萸Tetradium glabrifolium占3.33%、柘Maclura tricuspidata 占6.67%。结论：市场上苦木药材存在混伪品,DNA条形码技术能有效鉴别药材真伪。