菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆与原核表达分析＊

目的 克隆菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的全长编码序列，利用原核系统表达融合蛋白，为进一步研究该基因在菊花脑萜类合成中的功能提供理论依据。方法 以菊花脑基因组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增CnTPS1的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qRT-PCR技术分析CnTPS1基因在不同组织中的基因表达量。构建原核表达载体，体外诱导目的蛋白表达。结果 CnTPS1编码序列全长1749bp，编码582个氨基酸；基因表达模式分析表明该基因在茎和管状花中表达量较高；原核表达系统能诱导出67.58kDa大小的蛋白。结论 首次从菊花脑中克隆得到一个芳樟醇合酶基因CnTPS1，运用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构特征等进行了分析预测，分析了该基因的组织表达模式，并在原核表达系统中成功诱导表达出目标蛋白，这些结果将为菊花脑萜类合酶基因的功能以及萜类物质生物合成途径的解析提供理论依据。     

大花胡麻草环烯醚萜合酶基因的克隆与表达分析

目的克隆大花胡麻草环烯醚萜合酶基因(CgIS),并进行表达分析。方法以大花胡麻草根、茎、叶转录组中唯一的CgIS基因序列为基础,采用RT-PCR技术从大花胡麻草幼叶克隆CgIS基因,并进行组织特异性表达分析。结果大花胡麻草CgIS基因(GenBank登录号MH794270)全长1 185 bp,编码394个氨基酸;CgIS蛋白相对相对分子质量44 670,理论pI为6.17;该蛋白属于孕酮5β-还原酶(P5β-R)家族成员,可能定位于细胞质;该蛋白无信号肽,为亲水稳定蛋白,主要由α-螺旋(40.61%)和无规则卷曲(46.70%)构成;该蛋白具有SDR(短链脱氢酶/还原酶)和P5βR蛋白保守结构域;CgIS蛋白与芝麻SiIS蛋白亲缘关系最近;CgIS基因主要在叶中表达。结论克隆了CgIS基因,并对其进行表达分析,为进一步研究该基因的功能和环烯醚萜类的生物合成途径奠定基础。     

灰毡毛忍冬LmC3H1基因的克隆及表达模式与绿原酸含量相关性分析

目的:以灰毡毛忍冬为材料,克隆对-香豆酸3-羟化酶(LmC3H1)基因,进行生物信息学和表达模式分析,结合绿原酸含量,研究推测灰毡毛忍冬LmC3H1基因的功能。方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和RACE技术克隆LmC3H1基因的全长c DNA序列,对该序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和HPLC分别测定灰毡毛忍冬茎、叶及不同花期花中LmC3H1的相对表达量及绿原酸含量。结果:克隆得LmC3H1(Gen Bank:MN177695)基因,开放阅读框(ORF)长度为1 533 bp,编码510个氨基酸,推测其分子式为C_(2618)H_(4134)N_(718)O_(727)S_(22),相对分子质量为58 005.32,等电点8.92,为亲水性蛋白,定位于叶绿体中,具有跨膜区域LLLIPAVLFLISLVYPLI,含有细胞色素P450的保守结构域CYTOCHROME_P450(422-433 aa);Real-time PCR结果显示,LmC3H1在灰毡毛忍冬茎、叶及不同花期花有不同程度的表达,其中在花发育阶段,白色花蕾期相对表达量最高,花蕾初期及白色开花期次之;白色花蕾期花与茎、叶比,花的相对表达量最高,叶的最低;HPLC结果显示,从绿白色花蕾期到金黄色开花期绿原酸含量呈上升趋势,金黄色开花期含量最高,不同器官中,花中绿原酸最高,茎最低。结论:克隆得到灰毡毛忍冬LmC3H1基因,推测LmC3H1可能参与灰毡毛忍冬花绿原酸的生物合成。该研究为进一步研究该基因的功能及探究灰毡毛忍冬绿原酸生物合成和调节机制提供了依据,同时为遗传改良灰毡毛忍冬品质奠定了基础。     

五味子PLR基因及其启动子的克隆与表达分析

目的从五味子中克隆木脂素生物合成途径松脂醇-落叶松脂素还原酶(Pinoresinol-lariciresinol reductases,PLR)基因及其启动子序列,并进行生物信息学与表达分析。方法根据转录组PLR测序序列设计特异性引物,克隆ScPLR并进行生物信息学分析;采用TAIL-PCR对Sc PLR启动子序列扩增,并进行序列分析;采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析果实不同发育时期ScPLR的表达。结果 Sc PLR基因开放阅读框(ORF)全长837bp,编码278个氨基酸;ScPLR蛋白相对分子质量31419.85,理论等电点8.97;具有跨膜结构,无信号肽,为稳定性疏水蛋白,主要由α-螺旋和无规卷曲构成;亚细胞定位预测Sc PLR主要定位于细胞质;系统进化显示Sc PLR与蓖麻PLR亲缘关系较近。克隆到Sc PLR基因启动子长994bp,具有TATA-box、CAAT-box基本元件、光调控、生长素响应、厌氧诱导、防御和应激反应的多种调控元件;qRT-PCR结果显示ScPLR表达量呈现果实膨大期快速增加而进入着色期迅速降低的变化趋势。结论获得了Sc PLR基因及其启动子序列,ScPLR果实着色期之前高水平表达的趋势和木脂素的动态变化相一致,为进一步研究该基因功能及表达调控奠定了理论基础。     

Construction of cloning‐friendly minigenes for mammalian expression of full‐length human NF1 isoforms

The neurofibromatosis type 1 (NF1) tumor suppressor gene is one of the most frequently mutated genes in human tumors. Research on the NF1 proteins has been partially hindered by the difficulties in cloning and propagating the full‐length coding cDNAs. We have now established a condition for propagating the natural open reading frames (ORFs) and have assembled the ORFs for human NF1 type 1 and 2 isoforms. Furthermore, we were able to eliminate the cDNA cloning toxicity by introducing a mini‐intron. These NF1 minigenes were expressed similarly to the intronless version and could be used to purify full‐length NF1 proteins. The NF1 isoforms expressed from the minigenes showed Ras‐GAP activity in vivo and in vitro, while the type 1 was more potent. Our constructs expand currently available full‐length NF1 constructs and should be valuable tools in expediting the understanding of NF1, particularly the isoform‐specific functions and regulation.     

幽门螺杆菌细胞空泡毒素毒性片段基因的表达及其重组蛋白免疫学鉴定

目的采用基因工程技术获得具有良好免疫反应性的重组细胞空泡毒素的毒性亚单位蛋白。方法利用PCR技术从Hp基因组中扩增VacA基因毒性片段,插入原核表达载体pQE30上,测序后,转化表达宿主菌DH5α,SDSPAGE分析表达情况,Western blot检测其免疫反应性。NiNTA^2＋树脂纯化后,用重组蛋白免疫兔,Helico Blot试剂盒检测兔血清VacA抗体以鉴定其免疫原性。结果测序表明目的序列完整,与Genbank中的多株中国菌株相比有高度的同源性。SDS—PAGE显示表达产物相对分子量为27000。表达量为30％以上。该蛋白可被Hp全菌抗血清所识别,纯化后可得到纯度为93％以上蛋白质,并证实有良好的免疫原性。结论Hp VacA基因毒性片段表达成功,获得高纯度重组蛋白并具有良好的免疫反应性与免疫原性,为研制疫苗和制备诊断VacA（＋）株感染试剂盒提供了可靠材料。     

药用真菌猪苓菌核无机磷酸盐转运蛋白基因的分子克隆与特性分析

目的克隆猪苓Polyporus umbellatus菌核无机磷酸盐转运蛋白基因并进行生物信息学和表达模式分析。方法采用RT-PCR技术从猪苓菌核中克隆得到1个无机磷酸盐转运蛋白(inorganic phosphate transporter)基因,利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域、信号肽和跨膜结构等分子特性;采用Clustal W2以及MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;实时荧光定量PCR分析基因表达模式。结果猪苓无机磷酸盐转运蛋白基因命名为Pu Pi T(NCBI登录号:KU179154)。该基因开放读码框全长为1 590 bp,编码530个氨基酸。Pu Pi T蛋白相对分子质量为57 552,等电点6.82。氨基酸序列分析表明,Pu Pi T蛋白具有12个跨膜区。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示Pu Pi T与Moniliophthora rorer亲缘关系最近,与Moniliophthora roreri、双色蜡蘑Laccaria bicolor、Heterobasidion irregulare有较高的同源性,荧光定量PCR结果表明,Pu Pi T在与蜜环菌共生的猪苓菌核及未与蜜环菌共生的菌核中都有表达,其中共生部分的表达量显著上调,约是未共生部位的12倍,说明其参与猪苓与蜜环菌共生过程。结论 Pu Pi T基因克隆和分子特征为进一步研究揭示其在猪苓菌核磷元素转运及与蜜环菌共生过程中的调控作用奠定基础。     

人参中苯甲酸胁迫响应基因WRKY7的克隆与表达分析

WRKY转录因子是高等植物中最重要的转录因子基因家族之一,其在植物形态建成、生长发育以及应对生物(病菌、害虫等)、非生物(干旱、盐、冷、热等)胁迫过程中发挥重要作用。该研究根据人参化感自毒物质苯甲酸诱导的人参转录组数据,设计全长扩增引物,利用RT-PCR方法获得1条编码WRKY转录因子的基因,暂命名为WRKY7,并对其进行TA克隆、测序和序列分析。该基因cDNA全长1 216 bp,其开放阅读框(open reading frame,ORF)为1 014 bp,编码337个氨基酸。序列分析及系统进化分析表明,该蛋白属于WRKY家族第Ⅲ类成员,与西洋参种的WRKY6转录因子亲缘关系最近,同源性为87%。实时荧光定量PCR分析发现,苯甲酸胁迫后WRKY7的表达量显著升高,推测该基因可能参与了人参响应苯甲酸胁迫的过程,为进一步研究人参自毒胁迫响应的分子机制奠定了基础。     

变形链球菌乳酸脱氢酶基因及同源区的克隆和序列分析

目的：克隆变形链球菌乳酸脱氢酶基因(ldh)及其两侧同源区基因片段。方法：应用PCR技术扩增乳酸脱氢酶及其两端同源区序列片段，插入克隆载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α，Amp^ 抗性挑选阳性克隆，经酶切及PCR鉴定后进行序列测定。结果：PCR扩增产物特异；抗性筛选的4株菌落均为阳性克隆；用DNASIS将序列测定的结果与基因Bank中报道的序列对比分析，同源性为99．1％。结论：根据同源性分析的结果，可确定该克隆片段为变形链球菌乳酸脱氢酶及其两侧同源区序列。