左归丸含药血清调节Runx2激活ALP、OPN蛋白促进BMSCs增殖和分化的研究

目的 探讨左归丸（Zuoguiwan,ZGW）的补肾填精、益髓壮骨的作用,促进骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的增殖和向成骨细胞方向分化。方法 制备ZGW含药血清,设置10% FBS DMEM组、成骨诱导液组、2.5%空白大鼠血清-成骨诱导液组、2.5% ZGW含药血清-成骨诱导液组。采用MTT法观察各组对BMSCs的增殖,使用碱性磷酸酶钙钴染色法检测BMSCs向成骨细胞方向的分化能力,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）法检测细胞培养液中AKP的含量,Western blot检测BMSCs中Runt相关转录因子2（Runx2）、骨钙蛋白（osteocalcin,OPN）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）蛋白的表达。结果 2.5% ZGW含药血清-成骨诱导液组能够促进BMSCs的快速增殖,较早地进入平台期,促进BMSCs中AKP的分泌,提高ALP含量,上调BMSCs细胞中Runx2、ALP和 OPN的蛋白表达水平。结论 ZGW抗骨质疏松的分子机制,可能与调节Runx2激活ALP、OPN蛋白表达,促进BMSCs增殖和向成骨细胞方向分化有关。     

左归丸通过线粒体途径抗叔丁基过氧化氢诱导的MC3T3-E1细胞凋亡

目的:观察左归丸对叔丁基过氧化氢诱导的MC3T3-E1细胞凋亡的保护效应,探讨其作用机制是否与其干预线粒体途径有关。方法:以成骨细胞MC3T3-E1为研究对象,制备左归丸含药血清,建立叔丁基过氧化氢(t-BHP)成骨细胞MC3T3-E1氧化应激模型,实验分为空白组,t-BHP组,左归丸+t-BHP组,补佳乐+t-BHP组。孵育24,48,72 h后,采用噻唑蓝(MTT)法检测左归丸含药血清对t-BHP诱导MC3T3-E1细胞存活的影响;孵育48 h后,采用吖啶橙溴乙啶(AO/EB)染色法检测细胞凋亡,采用Hoechst 33342染色法观察凋亡细胞核变化,采用罗丹明123荧光染色法观察线粒体膜电位的改变,采用蛋白质免疫印迹(Western blot)法分析线粒体蛋白家族B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达水平。结果:与空白组比较,t-BHP组显著抑制细胞增殖(P0.05,P0.01),细胞凋亡增加,线粒体膜电位降低,Bcl-2蛋白表达明显下调(P0.01);与t-BHP组比较,左归丸加t-BHP组促进暴露于t-BHP诱导的MC3T3-E1氧化损伤细胞的存活(P0.01),48 h者尤佳,逆转细胞凋亡情况,提高细胞线粒体膜电位,上调Bcl-2蛋白表达(P0.05),抑制Bax和Caspase-3蛋白表达(P0.01)。结论:左归丸含药血清能够抗t-BHP诱导的MC3T3-E1细胞凋亡,其作用机制可能与其干预线粒体途径有关。     

左归丸抗乳腺癌转移及其作用机制

目的:观察左归丸的抗乳腺癌转移作用,探讨其作用机制。方法:采用股骨内注射法建立人乳腺癌细胞MDAMB-231骨转移裸鼠模型,受试裸鼠随机分为空白组(蒸馏水),左归丸低、高剂量(21,42 g·kg-1)组。连续给药8周后,采用巢式聚合酶链式反应(PCR)检测裸鼠骨髓组织中人细胞角蛋白(ck19)基因的表达,确定肿瘤转移情况;采用Oris法,检测左归丸含药血清对乳腺癌细胞MDA-MB-231体外迁移能力的影响;采用重组基底膜侵袭法,观察左归丸含药血清的体外抗侵袭作用;采用Alexa Fluor488标记的鬼笔环肽(Phalloidin)进行荧光染色,观察左归丸含药血清对乳腺癌细胞纤维型肌动蛋白(F-actin)聚合的影响;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测左归丸含药血清对MDA-MB-231细胞甲状旁腺激素相关蛋白(PTHr P)和4型趋化因子受体(CXCR4)表达的影响。结果:与空白组比较,左归丸高、低剂量均可显著抑制小鼠骨髓组织中人ck19基因表达(P0.01)。Oris迁移表明,左归丸含药血清可显著抑制转化生长因子-β(TGF-β)诱导的MDA-MB-231细胞迁移;重组基底膜侵袭实验显示,左归丸含药血清也可显著抑制乳腺癌细胞对重组基底膜的侵袭能力。给药组侵袭细胞数较空白组显著降低(P0.01)。Phalloidin荧光染色结果显示,左归丸含药血清可显著抑制F-actin聚合,抑制F-actin聚合体的形成。Western blot结果表明,左归丸含药血清可显著抑制乳腺癌细胞PTHr P,CXCR4蛋白表达。结论:左归丸具有明显的抗乳腺癌骨转移作用,其机制与抑制肿瘤细胞PTHr P,CXCR4表达,从而直接抑制其体外运动活性相关。     

左归丸加减对雌激素缺乏骨丢失小鼠Th17/Treg亚群的影响

目的观察左归丸加减对雌激素缺乏骨丢失模型小鼠脾脏辅助性T细胞亚群17（Th17）/调节性T细胞亚群（Treg）亚群平衡的影响,并探讨其作用机制。方法 50只BALB/c小鼠按随机数字表法随机分为假手术组、卵巢切除模型组、左归丸加减（简称中药）小、中、大剂量组,共5组,每组10只。中药组分别给予中药小、中、大剂量（7.25、14.50、29.00 g/kg）,1天1次,1次约0.5 m L,连续用药12周;同时假手术组及模型组给予等量的生理盐水。采用酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测各组血清雌二醇（E2）水平,双能X线骨密度仪检测股骨骨密度（bone mineral density,BMD）,流式细胞仪胞内外双染色法检测脾脏单个核细胞Th17/Treg亚群比例,RT-PCR法检测脾脏单个核细胞IL-17A、TGF-βmRNA表达。结果与假手术组比较,模型组E2、BMD均降低（P〈0.05）,Th17亚群比例、Th17/Treg比值均升高（P〈0.05）,Treg亚群比例明显降低（P〈0.05）,IL-17A mRNA表达明显升高（P〈0.05）,TGF-βmRNA表达明显降低（P〈0.05）;与模型组比较,中药中、大剂量组BMD值明显升高（P〈0.05）,Th17亚群比例、Th17/Treg比值降低（P〈0.05）、Treg亚群比例升高（P〈0.05）,IL-17A mRNA表达降低（P〈0.05）及TGF-βmRNA表达升高（P〈0.05）。相关性分析显示BMD与血清E2水平、Treg亚群比例呈明显正相关（P〈0.05）,与Th17亚群比例呈明显负相关（P〈0.05）;血清E2水平与Treg亚群比例呈明显正相关（P〈0.05）,与Th17亚群比例呈明显负相关（P〈0.05）。结论 Th17/Treg亚群平衡状态与雌激素缺乏骨丢失存在相关性,左归丸加减能降低雌激素缺乏骨丢失小鼠Th17亚群比例,升高雌激素缺乏骨丢失小鼠Treg亚群比例。左归丸加减可能通过调节雌激素缺乏骨丢失小鼠Th17/Treg亚群平衡达到治疗作用,且该方无明显雌激素样作用。     

左归丸防治骨质疏松症的动物模型和评价方法

左归丸是滋阴补肾、填精益髓的经典名方,体现了"阳中求阴"的配伍思路,是防治骨质疏松症(OP)的常用有效方剂之一。OP动物模型模拟了OP在人体的病理状态和发病机制,是OP防治和新药研发的重要手段。该文详细论述了左归丸防治OP的2大类常用动物模型和特点,即原发性OP动物模型,包括去卵巢法动物模型和自发性老年OP动物模型;继发性OP动物模型,包括糖皮质激素诱导性动物模型,环磷酰胺诱导性动物模型以及肾大部切除性动物模型。左归丸防治OP的效用评价,包括酶联免疫吸附测定实验检测骨吸收标记物和骨形成标记物含量,双能X射线检测骨密度,显微CT分析骨小梁数量、骨小梁分离度、骨小梁厚度、骨体积/组织体积比以及骨表面/体积比,以衡量骨微结构水平,苏木精-伊红染色法观察骨病理形态,生物力学实验测试骨最大载荷力等生物力学特性。OP动物模型的成功与否,以及左归丸的药效作用,必须与5种不同的客观评价方法结合起来进行综合衡量,才能为左归丸的基础和临床研究提供科学的参考依据。但OP动物模型有待进一步优化,以凸显左归丸治疗OP的中医病机和证候特征。     

左归丸加黄芪对S180小鼠化疗后卵巢功能损害和抑瘤作用的研究

目的探讨左归丸加黄芪在干预环磷酰胺(CTX)联合顺铂(DDP)诱导的S180小鼠生殖内分泌功能损害的基础上对S180小鼠皮下肿瘤生长的影响。方法将80只C57BL/6雌性小鼠随机选取14只作为空白对照组,余皮下接种S180肿瘤细胞后随机分为3组,即模型对照组、化疗组、中药+化疗组,每组22只。动态观察肿瘤生长及动情周期,于用药前后分批处死小鼠,称取体质量、卵巢质量、肿瘤质量计算抑瘤率;采用酶联免疫吸附(ELISA)法动态检测各组小鼠血清的卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)及雌二醇(E2)水平。每组剩余小鼠按2∶1分别与成年雄性小鼠合笼,观察生育情况。结果①给药前各组血清FSH、LH、E2水平无显著性差异(P均>0.05);给药第11天及第26天,化疗组FSH、E2水平与各组比较均有显著性差异(P均<0.01),中药+化疗组与两对照组比较无明显性差异(P均>0.05)。LH水平化疗组与中药+化疗组比较无显著性差异(P>0.05);但化疗组与两对照组比较均有显著性差异(P均<0.01)。给药第26天,化疗组FSH、LH水平与各组比较均有显著性差异(P均<0.01),中药+化疗组与两对照组比较无显著性差异(P均>0.05)。化疗组和中药+化疗组E2水平无明显差异(P>0.05);化疗组明显低于两对照组(P<0.01)。②模型对照组肿瘤质量均明显高于化疗组和中药+化疗组(P均<0.01);化疗组和中药+化疗组间比较无显著性差异(P>0.05);化疗组和中药+化疗组抑瘤率均大于60%。结论左归丸加黄芪对化疗后小鼠卵巢生殖内分泌功能的损害有保护作用;并可增强化疗对肿瘤的抑制作用。     

补肾方剂左归丸（汤）对小鼠早期胚胎发育的影响

本研究通过体外用药，体外用给药小鼠血清及在体用药三种方式，以酒精制成胚胎发育迟缓模型，以气血双补方八珍汤作对照，应用补肾阴方左归丸，对体外培养的小鼠２细胞期至囊胚期胚胎发育进行了动态观察。     

补肾方药对老年大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质所属组织结构形态变化的影响

目的:观察左归丸、右归丸对老年大鼠HPA轴所属组织形态结构变化的影响。方法:以自然衰老大鼠为肾虚证动物模型,HE染色,光镜观察HPA轴所属组织结构的增龄性变化,以及补肾方药(左、右归丸)的改善作用。结果:老年大鼠垂体、下丘脑、肾上腺皮质组织形态结构呈现明显的老年性退化,左归丸、右归丸能不同程度改善这些组织结构。结论:左归丸、右归丸能从组织结构形态方面延缓下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴的老年性变化。     

补肾方药对老年大鼠下丘脑-垂体-肾上腙皮质所属组织结构形态变化的影响

目的：观察左归丸、右归丸对老年大鼠HPA轴所属组织形态结构变化的影响。方法：以自然衰老大鼠为肾虚证动物模型，HE染色，光镜观察HPA轴所属组织结构的增龄性变化，以及补肾方药（左、右归丸）的改善作用。结果：老年大鼠垂体、下丘脑、肾上腺皮质组织形态结构呈现明显的老年性退化，左归丸、右归丸能不同程度改善这些组织结构。结论：左归丸、右归丸能从组织结构形态方面延缓下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴的老年性变化。     

基于细胞自噬探讨左归丸对肾虚仔鼠皮肤发育的影响

目的:研究左归丸对先天肾虚仔鼠发育过程中皮肤内细胞自噬的影响及其机制,探索补肾填精法在生长发育异常中的应用价值。方法:36只雌雄比例为2∶1的大鼠进行配对,复合应激法刺激孕鼠构建先天肾虚仔鼠模型,根据将孕鼠处理方式不同,分为正常组,肾虚组,左归丸低、高剂量组(2,8 g·kg^-1)。正常组不造模给予生理盐水灌胃,肾虚组造模给予生理盐水灌胃,左归丸低、高剂量组造模给予左归丸悬浊液灌胃。切取出生后21 d仔鼠的背部皮肤,苏木素-伊红(HE)染色观察仔鼠皮肤显微结构形态,测量真皮层和表皮层厚度,蛋白免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分别检测仔鼠皮肤分泌型糖蛋白3a(Wnt3a)和β-连环蛋白(β-catenin)mRNA和蛋白表达量,免疫双荧光检测皮肤内自噬指标微管相关蛋白轻链3(LC3)和人死骨片1-泛素结合蛋白p62(SQSTM1-p62)的表达。结果:正常组仔鼠皮肤层次清楚,结构正常,肾虚组真皮层胶原排列疏松,左归丸低、高剂量组皮肤组成基本正常;与正常组比较,肾虚组仔鼠在皮肤的表皮层增厚,真皮层变薄(P<0.05);与肾虚组比较,左归丸低、高剂量组皮肤的表皮层和真皮层厚度的改变明显恢复(P<0.05)。与正常组比较,肾虚组仔鼠Wnt3a和β-catenin蛋白和mRNA表达明显下降(P<0.05);与肾虚组比较,左归丸低、高剂量组Wnt3a和β-catenin蛋白和mRNA表达升高(P<0.05)。同时免疫荧光法检测发现与正常组比较,肾虚组的LC3的表达上调,SQSTM1-p62表达下调;与肾虚组比较,左归丸可以逆转SQSTM1-p62和LC3的异常表达(P<0.05)。结论:左归丸可以通过增加仔鼠皮肤内Wnt3a和β-catenin蛋白和mRNA的表达,下调皮肤细胞自噬水平,改善先天肾虚仔鼠皮肤异常发育。