FLT3及FLT3-ITD突变体在HEK293T细胞的表达和纯化北大核心CSCD

目的构建fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)及FLT3-内部串联重复序列(FLT3-ITD)突变体的真核表达载体,在HEK293T细胞中稳定表达并通过免疫沉淀技术对蛋白进行纯化。方法从正常人及FLT3-ITD阳性急性髓系白血病患者骨髓干细胞中提取RNA,反转录为cDNA,使用带有流感病毒血凝素(HA)标签序列的特异性引物,采用PCR扩增出人FLT3及FLT3-ITD突变体编码区全长并克隆到CD530A-T2A-GFP载体上。重组的FLT3及突变体FLT3-ITD表达质粒,通过脂质体polyJ et转染到HEK293T细胞进行表达。使用HA抗体结合微珠沉淀带HA标签的FLT3及FLT3-ITD突变体蛋白。然后,通过HA肽段将蛋白竞争洗脱下来,洗脱下来的蛋白经银染染色。结果 FLT3及FLT3-ITD突变体全长编码序列成功构建到CD530A-T2A-GFP载体上,Western blot法及聚丙烯酰胺凝胶银染法成功检测到FLT3及FLT3-ITD突变体蛋白的表达、纯化。结论在HEK293T细胞中成功表达并纯化FLT3及FLT3-ITD突变体蛋白。     

靶向表皮生长因子受体Ⅲ型突变体的第三代嵌合抗原受体的构建与表达

目的：构建第三代靶向表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（EGFRvⅢ）的嵌合抗原受体表达载体,为肿瘤过继免疫治疗提供实验基础。方法：运用分子克隆方法将嵌合抗原受体的胞外抗原结合区（EGFRvⅢ单克隆抗体的轻链和重链可变区,EGFRvⅢscFv,726 bp）、铰链区/穿膜区（213 bp）、共刺激分子（CD28和CD137的胞内信号区,123 bp和126 bp）和免疫受体酪氨酸活化基序（CD3ζ链,336 bp）连接成EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3ζ（EGFRvⅢ/3CAR）,克隆入真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,转染293T细胞48 h后提取蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting检测EGFRvⅢ/3CAR的表达。结果： EGFRvⅢscFv和基因合成的CD28-CD137-CD3ζ表达框通过重叠延伸PCR拼接成EGFRvⅢ/3CAR,限制性内切酶片段分析和DNA测序均验证了重组载体序列完全正确,Western blotting应用抗人-CD3ζ抗体检测到EGFRvⅢ/3CAR在293T细胞中的完整表达（相对分子质量约58 kD）。结论：成功构建嵌合抗原受体EGFRvⅢ/3CAR表达载体,为嵌合抗原受体修饰T细胞靶向治疗肿瘤提供研究基础。     

PAK1在结直肠癌增长和转移中的作用

PAKs(p-21活化激酶)是分子量21 kD,Rho家族的小GTP酶;在哺乳动物中PAK有6种,可分成第1组PAKs(PAK1～3)和第2组PAKs(PAK4～6)。PAK1(p-21活化激酶1)是第1个被鉴定并且研究最多的PAK家族成员,PAK1的效应蛋白为Rac和Cdc42,在细胞形成、运动、生存和增殖调节中起重要作用;同时,在肿瘤的发生、发展过程中,PKA1也发挥着重要的作用。研究证实,PAK1与结直肠癌的侵袭和转移密切相关[1]。本文拟对PAK1在细胞运动、血管生理和血管再生期间信号传递、癌的发生和发展以及在     

斑马鱼mcm3合子基因敲除实验模型的构建与鉴定

目的 构建斑马鱼mcm3合子基因突变体,研究mcm3合子基因在斑马鱼胚胎早期发育中的作用.方法 利用系统发育树分析不同物种间mcm3基因的保守性;利用国家生物技术信息中心(NCBI)网站及Jalview软件序列比对,分析斑马鱼MCM3蛋白与人类MCM3蛋白之间的氨基酸同源性;用CRISPR/Cas9技术构建可稳定遗传的斑马鱼mcm3合子基因缺失突变体;提取胚胎的基因组DNA后进行基因测序,检测斑马鱼mcm3合子基因突变类型;利用原位杂交检测mcm3突变体中mcm3 mRNA的表达水平.结果 斑马鱼合子基因mcm3与人类mcm3基因同源,且高度保守;可稳定遗传的mcm3合子基因突变体成功构建;在mcm3突变体斑马鱼中,胚胎从第3天开始出现头和眼睛,其外部表型较野生型斑马鱼小,且mcm3纯合子胚胎在第8天后相继死亡;运用整胚原位杂交发现,mcm3在野生型斑马鱼的头部、眼睛、中后脑边缘、鳃、胸腺及内胚层组织中高表达,但在mcm3突变体斑马鱼中,mcm3 mRNA的表达水平明显降低.结论 斑马鱼mcm3基因缺失突变体成功构建,并且mcm3基因在斑马鱼的早期胚胎发育中起重要作用.     

肺癌细胞株中发现一种细胞周期素A2的异常剪接体

目的检测细胞周期素(cyclinA1和cyclinA2)在4种肿瘤细胞中的表达,探讨其与肿瘤发生的关系。方法采用RT PCR和DNA测序技术观察cyclinA1和cyclinA2的基因表达并进行序列分析。结果cyclinA1在4种肿瘤细胞中均未检测到表达,而cyclinA2在4种肿瘤细胞中均有表达;在肺癌细胞株(LTEP a2)细胞中,发现一种cyclinA2异常的剪接体,其保留了第四内含子,而缺失了第五外显子,其序列编码蛋白质也发生了突变,只保留了5′端194氨基酸。结论细胞周期素表达与肿瘤发生有一定相关性,LTEP a2细胞中存在细胞周期素A2异常表达,其机制与作用有待进一步的研究。     

血小板生成素突变体的克隆和扩增及其融合蛋白在大肠杆菌中…

目的：通过获得编码血小板生成素成熟肽Ｎ端１￣１９６个氨基酸的突变体ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＪＭ１０９中的表达，为Ｔｐｏ进一步的结构和功能研究提供材料来源。方法：用多聚酶链反应及ＤＮＡ重组技术，将ＰＣＲ产物克隆到ｐＵＣ１９载体并测序，然后克隆到表达载体ｐＭＡｌ－ｃ２上。     

苯磺酰胺类 mIDH2抑制剂的设计、合成及生物活性评价

目的设计并合成新型结构的苯磺酰胺类IDH2突变体抑制剂。方法在现有IDH2突变体抑制剂AGI-6780的基础上,基于其与靶蛋白结合的晶体结构,利用环合策略和生物电子等排原理,设计了两个系列苯磺酰胺类目标化合物。采用体外酶学活性测定方法评价目标化合物对IDH2~(R140Q)突变体活性的影响。结果与结论合成了12个未见文献报道的苯磺酰胺类目标化合物,其结构经~1H-NMR、MS谱确证。生物活性评价结果表明,大多数目标化合物对IDH2~(R140Q)突变体显示不同程度的抑制活性,5个目标化合物的IC_(50)达到纳摩尔级水平,其中Ⅰ-1和Ⅱ-1的活性最强,值得进一步研究。     

Detection of YMDD mutants using universal template real-time PCR

AIM: To establish a rapid and accurate method for the detection of lamivudine-resistant mutations in hepatitis B virus and monitor of lamivudine resistance during lamivudine treatment in patients with chronic hepatitis B virus infection. METHODS: We established a real-time PCR method using a universal template and TaqMan probe to detect YMDD mutants. Variants of YVDD and YIDD were tested by individual reactions (reaction V and reaction I) and total hepatitis B viruses were detected in another reaction for control (reaction C). Results were determined by deltaCt < 3.5 (deltaCt = Ct of reaction V or I - Ct of reaction C). Clones of the HBV polymerase gene containing different YMDD mutations were tested. Serum samples from 163 lamivudine-treated patients with chronic hepatitis B virus infection were detected using this method and the results were confirmed by DNA sequencing. RESULTS: As many as 1000 copies per milliliter of wide-type plasmid were detected and nonspecific priming was excluded. In the 163 samples from patients treated with lamivudine, lamivudine-resistant mutations were detected in 51 samples. CONCLUSION: This universal real-time PCR is a rapid and accurate method for quantification of YMDD mutants of HBV virus in lamivudine-treated patients and can be used to monitor lamivudine-resistant mutations before and during lamivudine therapy.     

C基因截短突变体抗乙型肝炎病毒作用机制的研究

目的 探讨C基因截短突变体抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用机制。方法 构建C基因截短的真核表达载体pcDNA3-△C及野生型C基因真核表达载体pcDNA3-C，瞬时转染HepG2细胞，用SDSPAGE western blot检测pcDNA3-△C、pcDNA3-C的蛋白表达。pcDNA3-△C与adwR9共转染HepG2细胞，以pcDNA3与adwR9为对照，用荧光定量PCR检测培养上清液及细胞内病毒量，用Native western blot分析C基因截短蛋白干扰核心颗粒形成。结果重组载体pcDNA3-△C、pcDNA3-C均可表达，DcDNA3-△C与adwR9共转染组上清液和细胞内病毒量较对照组降低，pcDNA3-△C和pcDNA3-C共转染组Native western blot条带与pcDNA3和pcDNA3-C共转染组条带相比较明显淡。结论 C基因截短突变体可干扰核心颗粒的形成，导致HBV复制下降。     

BCR-ABL SH3-T79Y突变体重组腺病毒载体的构建及促进白血病K562/G01细胞凋亡

目的探讨构建BCR-ABL SH3-T79Y突变体(简称SH3-T79Y突变体)的重组腺病毒载体及其对白血病耐药细胞株K562/G01细胞凋亡的影响。方法以p Mig210质粒为模板,用重叠延伸PCR扩增SH3-T79Y突变体片段,将其克隆入重组腺病毒载体,通过鉴定、包装、扩增后得到含SH3-T79Y突变体的重组腺病毒。将重组腺病毒感染白血病K562/G01细胞株,测定其感染效率,瑞氏染色检查细胞形态学,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测BCR-ABL、Crk L磷酸化及总蛋白水平。结果重组腺病毒载体构建成功。SH3-T79Y突变体转染K562/G01细胞株72 h效率大于80%,可见明显的凋亡小体、核聚集等凋亡现象,凋亡率为32.46%,较对照组显著增加(P0.05);明显抑制BCR-ABL和Crk L的磷酸化水平,降低BCR-ABL总蛋白表达(P0.05)。结论成功构建SH3-T79Y突变体重组腺病毒载体,并证实其通过抑制BCR-ABL及底物Crk L磷酸化水平促进K562/G01细胞凋亡。