益骨胶囊含药血清对共育体系中破骨细胞活性和凋亡的影响

目的： 观察益骨胶囊含药血清在成骨-破骨细胞共育体系中对SD大鼠破骨细胞（OC）活性和凋亡的影响。 方法： (1)取1d龄SD大鼠颅骨分离培养成骨细胞（OB），取5d龄SD大鼠四肢股骨、胫骨分离培养OC，建立细胞上清相通但细胞间不相互混杂的平面式成骨-破骨细胞共育体系，实验分为含药血清组和对照组；（2）将10月龄SD雌性大鼠分为益骨胶囊灌胃组和生理盐水对照组，制备含药血清和对照血清；（3）重氮盐法检测抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和光镜观察骨陷窝数；（4）光镜和荧光显微镜下观察共育体系中OC凋亡情况。 结果： 含药血清组在48 h、72 h、96 h对成骨-破骨细胞共育体系中OC分泌TRACP的活性均明显降低于对照组，OC的存活数明显低于对照组，OC的凋亡率明显高于对照组且呈明显的时效关系；所形成骨吸收陷窝的数目明显低于对照组(P<0.01)。 结论： 益骨胶囊含药血清在共育体系中能够抑制OC活性，诱导破骨细胞的凋亡。     

益骨胶囊对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织骨形态发生蛋白2表达的影响

背景：骨形态发生蛋白-2是高教骨诱导因子。骨形态发生蛋白-2诱导骨内、外膜和骨髓基质细胞分化为骨母细胞，有加强骨床再生能力的作用，还可以活化或诱导血管周围的间充质细胞分化为软骨和成骨细胞。 目的：观察益骨胶囊预防和治疗用药对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织骨形态发生蛋白-2蛋白表达的影响。 设计：随机分组设汁、对照实验。 单位：暨南大学附属第一医院中医科。 材料：实验于2003-03／10在暨南大学中药学实验室完成。动物：选择10月龄普通级雌性SD大鼠72只，体质量（380&;#177;20）R，由广东省医学蛮验动物中心提供（合格证号：粤检证字第2002A024号）。随机抽取24只分为假手术（腹部切口但不切除卵巢）预防用药组（12只）和治疗用药组（12只），余48只行腹部切口双侧卵巢切除术复制骨质疏松模型后随机分为4组：模型预防用药组、模型冶疗用药组、预防用药组、治疗用药组，每组12只。药物：益骨胶囊南淫羊藿、枸杞：产、熟地黄、牛膝等组成，深圳三九医药股份有限公司提供免煎颗粒，配制成水溶液，含生药1．0g／mL。干预：益骨胶囊预防用药于手术后3d即开始灌胃，假手术预防用药组、模型预防用药组灌胃生理盐水3ml、预防用药组灌胃益骨胶囊水溶液3mL，1次／d。共24周；益骨胶囊治疗用药于手术后第13周开始灌胃，假手术治疗用药组、模型治疗用药组灌胃生理盐水3mL、治疗用药组灌胃益骨胶囊水溶液3mL。1次／d，共12周。免疫组化方法检测骨组织骨形态发生蛋白-2蛋白表达。 主要观察指标：骨组织骨形态发生蛋白-2阳性反应细胞的平均灰度值。 结果：大鼠造模24周时，模型预防用药组、预防用药组、假手术预防用药组大鼠骨组织骨形态发生蛋白-2阳性反应细胞的平均灰度值分别为81．84&;#177;10．01，124．46&;#177;6．55，130．15&;#177;10．09，模型预防用药组明显低于假手术预防用药组（P〈0．01），预防用药组显著高于模型预防用药组（P〈0．01），与假手术预防用药组相近（P〉0．05）。模型治疗用药组、治疗用药组、假手术治疗用药组大鼠骨组织骨形态发生蛋白-2阳性反应细胞的平均灰度值分别为77．97&;#177;10．35，110．32&;#177;8．69。131．79&;#177;12．10，模型治疗用药组明显低于假手术治疗用药组（P〈0．01），治疗用药组显著高于模型治疗用药组（P〈0．01），与假手术治疗用药组相近（P〉0．05）。 结论：益骨胶囊预防和治疗用药均能促进骨组织骨形态发生蛋白-2蛋白表达.     

去势雌鼠骨计量学指标及星体积变化与益骨胶囊的干预作用

目的：观察益骨胶囊对去卵巢骨质疏松症大鼠骨计量学相关指标及星体积变化的影响。方法：本实验于2003-01／2004—06在暨南大学完成。选用32只SD雌性大鼠，随机分为4组假手术组、模型组、益骨胶囊高、低剂量预防组，每组8只，除假手术组其他24只大鼠制成骨质疏松症模型。术后3d开始灌药，假手术组、模型组每天给予生理盐水11．6mL／kg灌胃；益骨胶囊低剂量组、益骨胶囊高剂量组每天分别给予低(含生药1．0g／mL)、高(含生药3．0g／mL)剂量益骨胶囊溶液11．6mL／kg灌胃，全部大鼠在处死前第14，13，3，2d，分别给予皮下注射盐酸四环素25mg／kg和钙黄绿素5mg／kg，在骨表面形成黄色和绿色两层双荧光标记，动态观察2次注射期间骨形成的情况。术后24周处死全部大鼠，取胫骨近端经处理制作骨切片在荧光显微镜下观察，进行骨小梁结构基本参数测算及定量分析；取股骨远端经处理制作骨切片，苏木精一伊红染色后进行星体积测定。结果：①骨小梁指标：骨小梁面积(反映骨量的多少)模型组明显低于假手术组【(22．2&;#177;3．48)%，(41．13&;#177;4．47)％，P&;lt;0．01】，益骨胶囊组显著高于模型组【(36．08&;#177;6．06)%，【41．53&;#177;5．49)％，【22．21&;#177;3．48)％。P&;lt;0．01】，且高剂量组略高于假手术组【(41．53&;#177;5．49)％，(41．13&;#177;4．47)%；骨小梁宽度及数量(反映骨小梁结构形态及骨量变化)与连接点数模型组显著低于假手术组，益骨胶囊组明显高于模型组，高剂量组接近于假手术组；骨小梁分离度及游离末端数模型组显著高于假手术组，益骨胶囊组明显低于模型组。②骨矿化沉积率(代表成骨细胞的活性及每天骨矿化速度)：模型组明显高于假手术组【(1．95&;#177;0．21)．(1．52&;#177;0．11)μm／d，P&;lt;0．01】，益骨胶囊组显著高于假手术组【(1．74&;#177;0．14)，(1．78&;#177;0．16)，(1．52&;#177;0．11)μm／d，P&;lt;0．05】。③星体积(反应松质骨骨小梁和骨髓腔的大小)：模型组显著高于假手术组【(0．1430&;#177;0．0219)，(0．0723&;#177;0．0168)mm^3，P&;lt;0．01】，益骨胶囊组显著低于模型组【(0．0598&;#177;0．0127)，(0．0467&;#177;0．0106)，(0．1430&;#177;0．0219)mm^3，P&;lt;0．01】，且低剂量组和高剂量组均低于假手术组，高剂量组更为显著。结论：益骨胶囊能显著减少骨量丢失，改善骨质疏松模型大鼠的骨小梁结构，降低星体积，缩小骨小梁间隙，在提高骨形成速率的同时降低骨吸收速率．     

去势雌鼠骨计量学指标及星体积变化与益骨胶囊的干预作用

目的:观察益骨胶囊对去卵巢骨质疏松症大鼠骨计量学相关指标及星体积变化的影响。方法:本实验于2003-01/2004-06在暨南大学完成。选用32只SD雌性大鼠,随机分为4组假手术组、模型组、益骨胶囊高、低剂量预防组,每组8只,除假手术组其他24只大鼠制成骨质疏松症模型。术后3d开始灌药,假手术组、模型组每天给予生理盐水11.6mL/kg灌胃;益骨胶囊低剂量组、益骨胶囊高剂量组每天分别给予低(含生药1.0g/mL)、高(含生药3.0g/mL)剂量益骨胶囊溶液11.6mL/kg灌胃,全部大鼠在处死前第14,13,3,2d,分别给予皮下注射盐酸四环素25mg/kg和钙黄绿素5mg/kg,在骨表面形成黄色和绿色两层双荧光标记,动态观察2次注射期间骨形成的情况。术后24周处死全部大鼠,取胫骨近端经处理制作骨切片在荧光显微镜下观察,进行骨小梁结构基本参数测算及定量分析;取股骨远端经处理制作骨切片,苏木精-伊红染色后进行星体积测定。结果:①骨小梁指标:骨小梁面积(反映骨量的多少)模型组明显低于假手术组犤(22.21±3.48)%,(41.13±4.47)%,P<0.01犦,益骨胶囊组显著高于模型组犤(36.08±6.06)%,(41.53±5.49)%,(22.21±3.48)%,P<0.01犦,且高剂量组略高于假手术组犤(41.53±5.49)%,(41.13±4.47)%犦;骨小梁宽度及数量(反映骨小梁结构形态及骨量变化)与连接点数模型组显著低于假手术组,益骨胶囊组明显高于模型组,高剂量组接近于假手术组;骨小梁分离度及游离末端数模型组显著高于假手术组,益骨胶囊组明显低于模型组。②骨矿化沉积率(代表成骨细胞的活性及每天骨矿化速度):模型组明显高于假手术组犤(1.95±0.21),(1.52±0.11)μm/d,P<0.01犦,益骨胶囊组显著高于假手术组犤(1.74±0.14),(1.78±0.16),(1.52±0.11)μm/d,P<0.05犦。③星体积(反应松质骨骨小梁和骨髓腔的大小):模型组显著高于假手术组犤(0.1430±0.0219),(0.0723±0.0168)mm3,P<0.01犦,益骨胶囊组显著低于模型组犤(0.0598±0.0127),(0.0467±0.0106),(0.1430±0.0219)mm3,P<0.01犦,且低剂量组和高剂量组均低于假手术组,高剂量组更为显著。结论:益骨胶囊能显著减少骨量丢失,改善骨质疏松模型大鼠的骨小梁结构,降低星体积,缩小骨小梁间隙,在提高骨形成速率的同时降低骨吸收速率。     

益骨胶囊含药血清对成骨细胞骨保护蛋白mRNA表达的影响

目的:观察益骨胶囊含药血清对体外培养的大鼠成骨细胞骨保护蛋白mRNA的影响。方法:实验于2004-05/2005-02在广州暨南大学生命科学技术学院细胞与蛋白质工程实验室完成。选取12月龄SD雌性大鼠20只,随机分为2组。中药给药组(益骨胶囊由淫羊藿、当归、白芍、枸杞子等8味中药组成)和蒸馏水对照组,每组10只。运用大鼠灌胃的方法制备含药血清和对照血清,分离、培养新生大鼠的颅骨成骨细胞,传代后分为2组(含药血清组和空白血清对照组),每组8孔,分别在培养24,48h时用反转录聚合酶链反应技术测定特异性电泳条带所显示成骨细胞中骨保护蛋白mRNA的相对表达量,酶联免疫法检测48,72和96h时200mL/L终浓度培养上清中骨保护蛋白的浓度。结果:两组动物各10只,均无亡失,所取血清正常用于细胞培养。①成骨细胞在接种4h后可见部分细胞贴壁、伸展。随培养时间延长,细胞伸出较多突起,细胞形态为单核,多边形及梭形,培养2d细胞基本全部贴壁,主要为梭形或多边形,培养6d左右基本贴满瓶壁,呈铺路石样排列。单层铺满培养瓶后可出现重叠生长,传代细胞大约15d天左右开始形成矿化结节。②特异性电泳条带显示益骨胶囊含药血清培养后24h和48h成骨细胞骨保护蛋白mRNA的表达均高于空白血清对照组犤(0.196±0.015,0.236±0.016),(0.152±0.018,0.206±0.022),P<0.01犦;③200mL/L终浓度的益骨胶囊含药血清培养后48,72和96h成骨细胞骨保护蛋白的表达明显高于空白血清对照组犤(0.1230±0.0128,0.1681±0.0130,0.1983±0.0186),(0.1067±0.0106,0.1385±0.0126,0.1588±0.0121),P<0.01或P<0.05犦。结论:益骨胶囊含药血清具有促进成骨细胞表达骨保护蛋白的作用。提示益骨胶囊能够通过对成骨细胞的影响而对骨吸收环节具有抑制作用,但是否对其他信号通路也有作用尚待研究。     

ERK信号通路在檞皮素促大鼠MSCs成骨分化中的作用

目的:观察细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在檞皮素(QUE)促进SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化过程中的作用。方法:(1)用0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/LQUE干预MSCs,MTT法检测各浓度QUE对MSCs增殖的影响,碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒检测各浓度QUE对MSCsALP表达的影响;(2)用ERK1/2抑制剂干预后,加入QUE,用ALP测定试剂盒检测ALP的表达,ELISA法检测Ⅰ型胶原(ColⅠ)和骨钙素(BGP)的表达,Westernblotting检测ERK1/2的表达,荧光定量PCR检测转化生长因子β₁(TGF-β₁)mRNA、骨形成蛋白2(BMP-2)mRNA和核心结合因子α1(Cbfα1)mRNA表达。结果:(1)0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/LQUE剂量依赖性地促进MSCsALP的表达,同时能促进MSCs的增殖;(2)与空白组相比,QUE组ALP、BGP和ColⅠ表达均增加(P<0.01),加入ERK1/2抑制剂后,磷酸化的ERK1/2表达减少(P<0.05),同时ALP、BGP和ColⅠ表达降低(P<0.01);(3)与空白组比较,QUE组TGF-β₁mRNA、BMP-2mRNA和Cbfα1mRNA的表达均增加(P<0.05),加入ERK1/2抑制剂后这3个基因的表达都下降(P<0.05)。结论:一定浓度的QUE能促进MSCs的增殖和成骨分化,ERK通路的激活在此过程中起到了重要的作用。     

补肾活血中药复方对去卵巢大鼠骨密度和骨组织神经肽Y的影响

目的探讨补肾活血中药复方对去卵巢大鼠骨密度及血浆和骨组织神经肽Y(NPY)的影响及对防治骨质疏松的作用机制。方法选择6月龄SD雌性大鼠32只,随机分为假手术组、模型组、补肾活血中药复方低剂量组和高剂量组。模型组、复方低剂量组与高剂量组均行双侧去卵巢手术,手术1 w后中药复方低、高剂量组用灌胃法1.16 g/100 g和10.44 g/100 g给服中药,模型组灌服生理盐水,12w后观察各组大鼠骨密度的改变,采用实时荧光定量(RT-PCR)检测骨组织NPY m RNA的表达美联免疫吸附(ELISA)法检测各组大鼠血浆和骨组织NPY含量,Western印迹检测骨组织NPY的表达。结果与假手术组比较,模型组骨密度明显降低(P0.01),骨组织中NPY蛋白和m RNA的表达量明显升高(P0.01),血清和骨组织中NPY的含量也明显升高(P0.01)。中药复方低剂量和高剂量组骨密度明显高于模型组(P0.01),血浆和骨组织中NPY蛋白和m RNA的表达量明显降低(P0.01或0.05),但仍高于假手术组(P0.01)。结论补肾活血中药复方能够调节血浆和骨组织的NPY,这可能是其抗骨质疏松的作用机理之一。     

木樨草素对脂多糖诱导的小胶质细胞炎性反应的抑制作用

目的:以脂多糖(LPS)刺激小胶质细胞BV-2,体外模拟神经退行性疾病的炎症模型,探讨木樨草素的抗炎作用和机制。方法:采用LPS(0.1μg/mL)刺激小胶质细胞建立炎症模型,MTT法检测木樨草素对BV-2细胞的毒性作用;硝酸还原酶法检测木樨草素对LPS刺激BV-2细胞一氧化氮(NO)表达量的影响;一氧化氮合酶分型法检测木樨草素对LPS刺激BV-2细胞一氧化氮合酶(iNOS)活性的影响;Western Blot法检测木樨草素对LPS刺激BV-2细胞TLR4蛋白表达影响。结果:木樨草素低、中、高剂量及阳性药物能抑制LPS诱导的BV-2炎性反应。结论:木樨草素能够抑制小胶质细胞活化产生的炎症反应,其抗炎作用的机制可能是通过抑制TLR4信号通路而发挥效用。     

淫羊藿苷对大鼠间充质干细胞骨向分化过程中转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2表达的影响

背景:淫羊藿苷作为补肾中药淫羊藿的主要有效成分,能够有效促进间充质干细胞向成骨细胞分化.目的:观察淫羊藿苷在诱导间充质干细胞骨向分化过程中对转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2表达的影响,阐释其可能的诱导机制.方法:运用全骨髓贴壁法分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞:以20 mg/L淫羊藿苷作为间充质干细胞药物干预浓度,根据干预条件的不同将实验分为;空白组、经典组(加经典成骨诱导剂)、淫羊藿苷组、淫羊藿苷+经组:ELISA法检测各组转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2的表达.结果与结论:经典组、淫羊蓍苷组、淫羊藿苷+经组转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2值均高于空白组(P<0.05):各组第7天的转化生长因子β1,值高于14,21 d(P<0.01),各组不同诱导时间骨形态发生蛋白2值之间相比差异无显著性意义(P>0.05).提示上调转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2的表达量可能是淫羊藿苷诱导各组促进间充质于细胞骨向分化的作用机制之一.     

益骨胶囊对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织cbf α-1mNRA表达的影响

目的： 分析成骨细胞分化因子cbf α-1基因在去卵巢骨质疏松（OP）大鼠的表达水平，观察益骨胶囊的调节作用。方法: 将36只10月龄SD雌性大鼠随机分为假手术组、模型组、药物组,相应干预后,留取股骨,采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术测定cbf α-1 mRNA表达,以GAPDH基因为内参照,根据相对定量公式(2-ΔΔCt)分别计算模型组、药物组与假手术组表达差异倍数。结果: 根据相对定量公式分析显示:与假手术组相比，模型组大鼠骨组织中cbf α-1 mRNA表达下降（P<0.01）。而药物组cbf α-1 mRNA表达相当于假手术组的0.19－0.92倍(P>0.05)，明显高于模型组（P<0.05）。结论: 结果表明去卵巢OP模型大鼠骨组织cbf α-1基因表达降低，而益骨胶囊可上调cbf α-1的基因表达水平，这可能与其诱导骨髓间质干细胞分化为成骨细胞发挥其防治OP的作用有关。