QuEChERS法结合气相色谱-串联质谱法测定贝母类中药中53种农药残留

目的建立基于QuEChERS法结合气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)对贝母类中药中53种农药残留量的快速检测方法,并应用于193批样品筛查。方法根据调研选择禁限用及常用农药作为检测指标。采用QuEChERS法对样品进行前处理,在气相色谱-串联质谱多反应监测(MRM)模式下进行测定,以3个添加水平测定样品的回收率和RSD。结果 53种农药在一定含量范围内线性关系良好,r均大于0.997 8;在1倍LOD(Limit of Detection)、2倍LOD、10倍LOD 3个添加浓度水平进行回收率试验中,86.8%的农药在60%～140%,RSD均小于15%;各农药检出限均小于0.01 mg/kg。193批贝母类中药种共检出14种农药,91批样品有检出,检出率为47.2%,仅有1批超出即将执行的《中国药典》2020年版限度规定。结论该方法检测指标具有一定针对性,且操作简便快速、灵敏可靠,适用于贝母类中药中农药残留的筛查测定。对于贝母类中药的生产种植和流通监管具有一定的参考意义。     

HPLC法测定附子不同炮制品、川乌、参附注射液中腺苷的含量

目的:首次从附子中分得腺苷,并应用高效液相色谱法建立附子不同炮制品、川乌、参附注射液中腺苷含量的测定方法。方法:采用Diamonsil Cl8柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:甲醇-磷酸盐缓冲液(15:85);检测波长:260 nm;流速:1.0 mL/min。结果:腺苷在0.062~0.217μg范围内线性关系良好,R=0.9997,平均回收率为99.9%,RSD=2.41%。结论:本方法可靠、准确、简便,为评价附子不同炮制品、川乌、参附注射液的质量提供了科学依据。     

新型双启动子表达质粒pCMVnir的构建及其促进基因免疫效果的研究

目的 构建一种新型双启动子表达载体pCMVnir，研究其与胞内寄生菌联合应用促进基因免疫效果的作用。方法细菌硝酸盐还原酶基因B启动子nirB为厌氧诱导启动子，根据nirB启动子的结构，设计合成改良的nirB，置换三启动子载体pTriEx-4中的T7Lac和P10启动子，而保留其CMVie启动子，获得携带CMVie和nirB双种启动子的新型载体pCMVnir，或称为pCN。构建pCN-EGFP和pCN-DsRed两种报告质粒，分别转化S．SL3261、E．coil DH-15a和CHO等细胞，检测报告基因的表达情况以确定两种启动子的活性。pCN-EGFP转化S．SL3261，接种BALB／c小鼠，定期解剖小鼠收集黏膜相关淋巴组织，观察重组细菌和载体DNA在细胞中的定植及稳定性。免疫接种小鼠，并定期收集小鼠血清和阴道分泌物，以重组rEGFP为抗原，用EEISA方法研究其增强免疫应答的能力。并构建人乳头瘤病毒L1E7双启动子pCN-16L1E7及对照单启动子载体pCMV-16L1E7和pNir-16L1E7，对比三者涛导黏膜免疫的差别。结果双启动子表达载体pCMVnir可在细菌和真核细胞中有效表达报告基因，在细菌中可形成肉眼可见的荧光菌落和沉淀，转染CHO等真核细胞能够表达荧光蛋白，表明pC-MVnir载体的两种启动子都有活性，其中nirB活性是受兼性厌氧调控的。pCMVnir与细菌有较好的相容性，重组细菌可在动物体内有限复制和定植达6周，质粒可在细菌中稳定存在。以rEGFP为抗原检测发现pCN-EGFP诱导的免疫反应高于常用的单启动子载体pCMV-EGFP。人乳头瘤病毒双启动子载体pCN-16L1E7诱导的免疫反应也高于其他单启动子载体。结论双启动子表达载体pcMVnir与减毒胞内寄生菌匹配应用，能够提高抗原表达量及增强基因免疫反应的强度。并可作为一般基因克隆和表达载体，特别是作为原核表达载体，不用添加诱导物，即可获得大量表达。     

一种基于近红外的半夏炮制品快速鉴别方法

目的:分析法半夏、姜半夏、清半夏的近红外光谱,建立半夏不同炮制品的快速鉴别法.方法:采集半夏炮制品近红外光谱信息,结合二阶导数光谱、化学计量学技术,探究不同半夏炮制品的光谱差异及建立快速鉴别模型.结果:在近红外光谱中,半夏炮制品在8336.91、6861.57、6311.60、5861.42、5668.34、5162.24、4772.29、4330.16 cm-1处均有较强的振动吸收,表明半夏炮制品的主要化学组分较为相似.二阶导数光谱结合聚类、偏最小二乘法判别分析和K最近邻分类算法分析发现,半夏炮制品之间具有特征性差异.讨论:近红外光谱能快速有效地用于鉴别半夏炮制品,为半夏炮制工艺、质量评价提供科学的参考依据.     

减毒沙门氏细菌为载体的人乳头瘤病毒双启动子DNA疫苗载体构建

目的 :构建一种廉价高效的防治宫颈癌的人乳头瘤病毒新型双启动子DNA疫苗。方法 :设计合成细菌厌氧诱导启动子Nir ,含有FNR顺式反应元件、RBS和真核基因Kozak元件 ,插入pTriEx真核启动子CMVIE下游 ,构建pCMVnir双启动子载体。将人乳头瘤病毒 16型L1L7,融合基因 ,插入pCMVnir,制备pCMVnirL1E7,转化减毒沙门氏细菌SL32 6 1,厌氧诱导表达 ,SDS PAGE和Westernblot分析检测Nir启动子的活性。结果 :经DNA序列和限制性内切酶鉴定分析 ,成功构建了HPV双启动子DNA疫苗载体pCMVnirL1E7,转化沙门氏细菌SL32 6 1,厌氧条件下可诱导表达HPVL1E7蛋白质。结论 :成功构建了一种与胞内寄生细菌(减毒沙门氏细菌 )匹配的双启动子DNA疫苗新型载体 ,并构建了HPV16pCMVnirL1E7新型DNA疫苗     

含变形链球菌PAcA基因的真核表达质粒pcDNA3.1-PAcA的构建与鉴定

目的 :构建含有免疫刺激序列、可防止变形链球菌在牙面粘附的DNA疫苗。方法 :利用PCR技术由质粒pPAcA CTA2 B扩增编码PAcA的DNA片段 ;通过T A克隆技术将目的DNA片段克隆于载体pMD1 8 T ,鉴定插入方向后 ,将目的DNA从载体上释放 ,再克隆于含有CpG免疫刺激序列的真核表达载体pcDNA3 .1 ,构建出用作防龋疫苗的真核表达质粒pcDNA3 .1 PAcA。结果 :通过对重组质粒pcDNA3 .1 PAcA进行酶切图谱和DNA序列测定分析 ,证明真核表达重组质粒pcDNA3 .1 PAcA构建成功、阅读框架正确。结论 :利用T A克隆等技术可成功将编码PAcA的DNA片段克隆到含有免疫刺激序列CpG的真核表达载体pcDNA3 .1 ,构建出真核表达重组质粒pcDNA3 .1 PAcA。     

携带双启动子DNA疫苗载体的减毒沙门菌在体内定植及动态变化

目的：探讨双启动子DNA疫苗载体在减毒沙门菌中的稳定性和重组减毒沙门菌在小鼠体内的定植及动态变化。方法：将人乳头瘤病毒双启动子DNA疫苗载体pCN-16L1E7转化减毒沙门菌S-SL3261，经口服、鼻饲和皮肤途径免疫小鼠，在免疫后的第3、4、5、6周取小鼠粘膜相关淋巴组织，电镜观察细菌在组织中的定植；组织匀浆，细菌培养计数确定细菌的增殖；从细菌中提取质粒酶切鉴定以确定质粒的稳定性。结果：重组减毒沙门菌S-SL3261能在小鼠脾脏、肝脏和粘膜相关淋巴组织中定植，电镜可检测到多个细菌定植灶；重组减毒沙门菌可有效进入机体细胞并有限增殖达6周，在第4～5周菌落数量达到高峰，然后逐渐减少以至最后被清除。pCN-16L1E7可在减毒沙门菌中稳定存在，载体的产量和酶切图谱没有明显变化。结论：双启动子DNA疫苗载体pCN-16L1E7与减毒沙门菌有较好的相容性，能够在小鼠体内定植及有限增殖。口服、鼻饲和皮肤粘膜接种途径均可有效地将减毒沙门菌携带的DNA疫苗载体导入粘膜相关淋巴组织。     

乳头瘤病毒重组减毒沙门菌疫苗的构建及诱导黏膜免疫的研究

乳头瘤病毒在生殖道黏膜增殖传播 ,与妇女生殖道黏膜检测不到HPVIgA抗体有关 ,因此诱导生殖道黏膜HPV特异性抗体对于防治HPV性传播性疾病具有重要的价值。本研究采用细菌内源性诱导启动子nirB ,以霍乱毒素CTA2B亚单位为黏膜免疫佐剂 ,构建HPV16重组减毒沙门菌疫苗pNir 16L1E7CTA2B ,研究其诱导黏膜免疫的能力。减毒沙门菌S .SL32 6 1为一种aroA基因突变株。在携带霍乱毒素CTA2B黏膜免疫佐剂基因载体pET CTA2B的基础上 ,将pUC 16L1E7中的HPV16L1E7经PCR和T A克隆技术插入pET CTA2B ,获得pET 16L1E7CTA2B。确定启…     

HPV16L1E7的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：研究人乳头瘤病毒(HPV)的主要衣壳蛋白L1和主要的转化蛋白E7的融合基因在原核细胞中的表达，为研制HPVl6L1E7疫苗和诊断试剂盒提供依据。方法：采用聚合酶链反应(PCR)以重组质粒pUCl9UE7为模板扩增HPVl6L1E7基因片段，克隆至载体pMDl8-T中，并用限制性内切酶将HPVl6L1E7基因切下，克隆至原核表达质粒pQE30中，经IPTG诱导表达，再使用SDS-PAGE和蛋白印迹检测其抗原性和表达水平。结果：HPVl6L1E7融合蛋白能被抗HPVl6L1抗体识别，分子量为66KD，经IPTG诱导4h后，表达的HPVl6L1E7融合蛋白占菌体总蛋白量的25％以上。结论：成功构建的表达载体pOE30-L1E7可在原核表达细胞中高效表达，且表达出的HPVl6L1E7融合蛋白具有反应活性，可与HPVl6抗体发生反应。