雷公藤贝壳杉烯酸氧化酶基因的全长cDNA克隆与表达分析

贝壳杉烯酸氧化酶(kaurenoic acid oxidase)是二萜赤霉素生物合成途径上的关键酶,参与植物生长发育等重要生物学过程。该文根据雷公藤转录组数据设计特异性引物,采用PCR技术克隆得到贝壳杉烯酸氧化酶全长c DNA序列,并进行生物信息学分析;使用实时定量PCR(qRT-PCR)研究基因的诱导表达水平。克隆得到Tw KAO长度为1 874 bp,编码487个氨基酸,蛋白相对分子质量56.02 k Da,理论等电点8.89;经茉莉酸甲酯(Me JA)诱导后,Tw KAO基因相对表达量在12 h达到峰值;经植株组织表达分析证实,Tw KAO基因在雷公藤的叶中表达量最高,根中最低。该研究首次克隆得到雷公藤KAO基因,并分析其mRNA表达特征,为深入研究雷公藤生长发育以及萜类活性成分次生代谢研究奠定基础。     

比较蛋白质组学揭示茉莉酸甲酯诱导的雷公藤甲素生物合成

目的 探索雷公藤甲素生物合成途径,以提高其产量或用于合成生物学异源生产。方法 使用无标记（lable-free）比较蛋白质组学对茉莉酸甲酯（MeJA）诱导的雷公藤悬浮细胞进行测序,通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）、基因本体（GO）分析等方法,结合基因转录表达分析和基因体内功能研究,逐步筛选参与雷公藤甲素生物合成的功能基因。结果 MeJA诱导不同时间的样品组鉴定得到376个差异蛋白质,包括8个细胞色素P450酶（CYP450）、3个转录因子（TF）和2-氧戊二酸依赖的双加氧酶（2ODD）。其中CYP71BE89、CYP82AQ2和Tw2ODD基因在MeJA诱导及植物不同组织部位中,均与已知参与雷公藤甲素母核环化的二萜合酶TwTPS7(v2) 和TwTPS27(v2) 基因具有相似的表达模式,表明其可能与雷公藤甲素生物合成相关。进一步利用植物细胞体内功能研究,验证了CYP71BE89、CYP82AQ2和Tw2ODD基因干扰使雷公藤甲素积累分别降低了24.1%、41.4%和71.4%,表明了3个基因与雷公藤甲素生物合成直接相关。结论 利用比较蛋白质组学技术揭示了几种与雷公藤甲素生物合成相关的蛋白,进一步表征了雷公藤甲素生物合成与外源激素刺激之间的关系,并为发掘中药活性成分生物合成途径提供了一种有效方法。     

雷公藤单加氧酶基因全长克隆及表达分析

目的:单加氧酶(Monooxygenase,MO)是一类通过在底物上加一个氧原子的加氧酶,在动植物体内参与多种代谢途径。本实验致力于从雷公藤转录组数据中克隆得到单加氧酶基因c DNA全长,并对克隆得到的MO基因进行初步的功能分析。方法:通过对雷公藤转录组数据中筛选得到MO基因片段设计特异性引物,克隆MO基因c DNA全长,通过生物信息学方法对得到的MO基因进行分析,主要包括多重序列比对,蛋白结构预测和构建进化树分析等。结果:根据分析结果Tw MO基因全长为2 193 bp,共编码507个氨基酸,等电点为8.84,相对分子质量为55.20 k Da,多重序列比对显示它与其他植物的MO基因具有较高的同源性。雷公藤悬浮细胞经外源茉莉酸甲酯(Me JA)诱导后,实时荧光定量结果显示,TwMO的表达量明显增加,并在48 h达到最高,提示Tw MO基因与雷公藤的次生代谢产物的生成有关。结论:本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到MO基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达分析

该研究克隆得到1条雷公藤单萜合酶基因TwMS。其完整开放阅读框为1797bp,编码579个氨基酸,相对分子质量为69.75kDa、理论等电点为5.37。生物信息学分析表明,TwMS具有单萜合酶的特征结构域,属于萜类合酶TPSb亚家族。实时荧光定量PCR检测显示,经茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后,TwMS的相对表达量显著上调,并在24 h达到最高。此外,该研究在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达TwMS蛋白,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

中药活性成分"合成生物学"创造与新药发现——高伟教授

中药活性成分不仅是中医药发挥临床疗效的活性物质,还是现代创新药物开发的源泉,在医药领域具有广泛的应用价值。高伟教授团队致力于克隆鉴定中药活性成分生物合成途径上关键酶基因,解析其生物合成途径,并利用合成生物学方法人工重建代谢途径,构建细胞工厂发酵生产和改造活性成分。这一极具潜力的研究策略和创新型生产模式,在减少自然资源依赖、维护环境友好和实现大规模生产等方面具有重大科学价值。     

雷公藤TwCYP88A1基因全长cDNA克隆与表达分析

目的:研究雷公藤萜类成分的生物合成相关基因,在雷公藤转录组信息数据的基础上,以雷公藤悬浮细胞为研究材料,克隆Tw CYP88A1基因。方法:采用c DNA末端快速扩增技术(RACE)克隆雷公藤Tw CYP88A1基因,实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)分析其组织表达谱。结果:Tw CYP88A1 c DNA全长1 594 bp,编码491个氨基酸,等电点9.16,相对分子质量55.957 k Da,具有半胱氨酸铁血红素配体信号活性催化位点。植物组织表达分析表明Tw CYP88A1基因在雷公藤叶中的表达量最高,根中最低。结论:从雷公藤悬浮细胞中克隆得到Tw CYP88A1基因全长c DNA,对其进行生物信息学分析,揭示其组织表达谱,为深入分析雷公藤细胞色素P450酶、解析雷公藤萜类化合物的生物合成下游途径奠定基础。     

雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS克隆与表达分析

根据雷公藤悬浮细胞转录组数据设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增技术克隆雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS1,TwGPPS2全长cDNA,并进行生物信息学分析和蛋白表达研究。首次克隆得到TwGPPS1核苷酸的完整开放阅读框长度为1 278 bp,编码425个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.68,相对分子质量为47.189 kDa;TwGPPS2核苷酸的完整开放阅读框长度为1 269 bp,编码422个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.71,相对分子质量为46.774 kDa;进一步构建了原核重组表达载体pET-32a-TwGPPS1,pET-32a-TwGPPS2,并成功诱导出TwGPPS1,TwGPPS2重组蛋白,为深入研究此关键酶基因功能和雷公藤萜类生物合成途径奠定基础。     

雷公藤4α-甲基氧化酶基因(TwSMO1)的cDNA全长克隆及表达分析

目的:克隆得到雷公藤一型4α-甲基氧化酶(Tw SMO1)(Gen Bank KX987126)全长基因,并对其进行序列分析及初步的功能验证。方法:根据雷公藤转录组数据,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到雷公藤4α-甲基氧化酶基因(TwSMO1),并利用相关软件对所得核酸序列及其所编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。用茉莉酸甲酯(MeJA)诱导雷公藤悬浮细胞,用实时荧光定量(RT-PCR)的方法分析诱导不同时间点后雷公藤悬浮细胞中的TwSMO1基因的相对表达量。结果:克隆所得的TwSMO1基因cDNA全长1505 bp,开放阅读框900 bp,编码299个氨基酸,在线预测其所编码蛋白分子量为34.55 k Da,理论等电点为6.89。多重序列比对结果显示其与其他物种的SMO1氨基酸序列有较高同源性,且包含SMO1基因家族的3个保守域,系统进化树将其归为4α-甲基氧化酶第一家族基因,遂将其命名为TwSMO1。RT-PCR结果表明MeJA诱导后TwSMO1基因在1 h后表达量达到最高,约是对照组的450倍。结论:本研究首次克隆得到雷公藤TwSMO1基因,并对其进行生物信息学分析及MeJA诱导表达分析,为深入研究此基因功能及阐述雷公藤甾醇生物合成途径奠定基础。     

红花黄酮类糖基转移酶基因CtUGT49功能表征及酶学特性分析

红花作为传统的活血化瘀中药，具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等药理活性。黄酮糖苷是红花植物的主要生物活性组分，糖基转移酶作为活性糖苷化合物生物合成的下游后修饰酶，具有重要的研究意义。该研究基于红花转录组数据分析，挖掘到一条糖基转移酶基因CtUGT49,对其进行了系统的生物信息学分析和酶学性质考察。该基因开放阅读框(ORF)长度为1 416 bp,编码471个氨基酸残基，相对分子质量约为52 kDa。系统进化分析表明，该糖基转移酶属于UGT73家族。体外酶促结果显示，CtUGT49可催化柚皮素查尔酮生成樱桃苷和南酸枣苷；催化根皮素生成的主产物为根皮苷和三叶苷，并且具有良好的底物宽泛性。通过蛋白异源表达与纯化得到较为纯净的重组蛋白CtUGT49后，进行CtUGT49催化柚皮素查尔酮的酶学性质考察。结果显示，CtUGT49催化反应的最适pH为7.0,最适温度为37℃,反应8 h后，底物转化率达到最高。采用米氏方程计算CtUGT49的酶活常数K_m=209.90μmol·L^-1,k_cat=48.36 s^-1。该研究...