丹参SmRopGEF1基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

目的 克隆丹参SmRopGEF1基因,研究其编码蛋白的亚细胞定位及其对逆境胁迫的应激反应和激素诱导下的表达水平。方法 根据前期丹参转录组测序结果设计SmRopGEF1基因特异引物,利用聚合酶链式反应（PCR）扩增SmRopGEF1基因序列;使用生物信息学方法分析SmRopGEF1蛋白序列特征及进化关系;构建pET28a-SmRopGEF1原核表达载体并转化至大肠埃希氏菌中诱导表达,构建35S启动的SmRopGEF1的绿色荧光蛋白原生质体瞬时表达载体,利用激光共聚焦显微镜观察SmRopGEF1的亚细胞定位;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测逆境胁迫（低温、盐及干旱）和激素诱导（生长素、脱落酸、茉莉酸甲酯）下的基因表达量。结果 丹参SmRopGEF1基因开放阅读框（ORF）全长为1701 bp,编码566个氨基酸,蛋白相对分子质量是62 362.99。生物信息学分析显示SmRopGEF1蛋白含有1个PRONE保守结构域,系统进化树分析表明SmRopGEF1蛋白与芡欧鼠尾草和一串红RopGEF1蛋白为高同源蛋白。成功构建pET28a-SmRopGEF1原核表达载体并在大肠埃希氏菌Rosetta（DE3）菌株中表达、纯化出SmRopGEF1重组蛋白。亚细胞定位的结果显示SmRopGEF1存在于植物细胞的细胞核中。qRT-PCR实验结果表明盐胁迫和冷胁迫能够显著提高SmRopGEF1的表达量;干旱胁迫后丹参愈伤中SmRopGEF1表达量下降。茉莉酸甲酯诱导后SmRopGEF1表达量升高。结论 克隆了丹参SmRopGEF1基因,其在抗逆胁迫中起到重要作用并且可能参与茉莉酸甲酯信号转导。研究结果丰富了丹参防御反应机制的研究,为选育丹参抗逆优良品种、提高丹参的产量与品质提供了参考。     

桔梗特异DNA条形码筛选、种质资源鉴定及遗传多样性分析

中药材桔梗为桔梗科植物桔梗的干燥根,具有多种药理作用,是常用的大宗中药材。本研究利用Illumina HiSeq X Ten平台对6份来自不同产地的桔梗进行叶绿体基因组测序,筛选特异性DNA条形码,基于特异性DNA条形码对不同产区的桔梗样品的种质资源和遗传多样性进行分析。6份桔梗叶绿体基因组全长为172 260～172 275 bp,均呈现典型的环状四分体结构,编码141个基因。根据比较基因组学分析和扩增效率分析发现trnG-UCC和ndhG＿ndhF可作为潜在的桔梗种内种质资源鉴定的特异性DNA条形码。对来自9省15个产地305份桔梗样品的trnG-UCC和ndhG＿ndhF进行PCR扩增和序列分析,结果表明trnG-UCC和ndhG＿ndhF分别有5和11个变异位点,分别鉴定到5和7个单倍型;两段序列联合分析鉴定13个单倍型(Hap1～Hap13),其中占比最多的是Hap4,其次是Hap1。3个产地拥有的特异单倍型,可作为该产地的DNA分子标签与其他产地的桔梗种质资源进行区分。单倍型多样性、核苷酸多样性和遗传距离分别为0.94、4.79×10-3和0.000 0～0.020 3,表...