血清中磷酯酰肌醇蛋白聚糖-3及高尔基体蛋白-73异常表达对肝癌的诊断价值

目的 :探究肝组织及外周血磷酯酰肌醇蛋白聚糖-3(phosphatidylinositol proteinglycan 3,GPC3)及高尔基体糖蛋白-73(Golgi protein 73,GP73)高表达对肝癌的诊断价值。方法 :用ELISA法检测39例肝癌患者及31例肝硬化患者外周血GPC3及GP73浓度,RT-PCR法检测两组患者肝组织中GPC3 m RNA及GP73 m RNA表达水平,比较研究肝癌及肝硬化患者外周血、肝组织中GPC3及GP73的表达差异,分层分析此两种蛋白表达与肝癌不同临床分期、病理分级的相关性。结果:肝癌组外周血GPC3、GP73浓度分别为(16.81±0.56)μg/L、(115.92±7.01)ng/ml,肝硬化组外周血GPC3、GP73浓度分别为(7.41±0.25)μg/L、(64.63±3.07)ng/ml,肝癌组外周血GPC3、GP73浓度均显著高于肝硬化组(P<0.001)。GPC3值为9.3μg/L时诊断肝癌的灵敏度和特异度分别为89.74%和96.77%,阳性预测值97.20%,阴性预测值88.20%;GP73截断值为77.68 ng/ml时,其诊断肝癌的灵敏度92.31%,特异度83.87%,阳性预测值87.80%,阴性预测值89.70%。肝癌组GPC3 m RNA和GP73 m RNA相对表达量分别为8.91±3.70、68.41±32.86,肝硬化组GPC3 m RNA和GP73 m RNA相对表达量分别为3.04±0.58、2.32±0.25,肝癌组GPC3 m RNA、GP73 m RNA表达均高于肝硬化组(P均<0.05)。上述结果可知肝癌患者癌组织GPC3、GP73 m RNA表达水平与外周血相应蛋白浓度一致。肝癌患者中外周血GP73、GPC3蛋白浓度及组织m RNA表达水平与年龄、性别、肿瘤大小及肝癌临床分期间无统计学意义;而肝癌患者GPC3表达与病理分级间存在统计学差异,病理分级为3级的肝癌患者GPC3表达水平低于1~2级患者。结论:GP73、GPC3在肝癌患者中表达明显增高,且灵敏度高于AFP,而特异度与其相当,有望成为一种新的、较好早期诊断HCC的血清标志物;另外,GPC3表达对肝癌细胞的分化程度有一定的指示作用。     

乙型肝炎病毒干预后小鼠肝脏树突状细胞P-干扰素调节因子3表达的研究

目的 研究HBV干预后小鼠肝脏树突状细胞P-干扰素调节因子3及其下游Ⅰ型干扰素表达的变化.方法用免疫磁珠分选法分离肝脏树突状细胞,并用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4在24孔板中诱导培养.用超离心技术获得HBV,并用实时荧光定量PCR检测.第5天将培养的树突状细胞分为2组:HBV组与HBV共同培养,对照组加入等量的细胞培养液.24 h后,两组均加入聚肌胞刺激,收集0、1、2、6、24 h的细胞和上清液,用Western blot检测P-干扰素调节因子3的表达情况,用酶联免疫吸附法检测上清液中干扰素β的浓度.组间比较用t检验.结果 0h时HBV组培养液上清液干扰素β浓度[(12.38 ±3.71)pg/ml]与对照组[(10.83±4.11)pg/ml]比较,差异无统计学意义(P>0.05).聚肌胞刺激后6 h,HBV组培养液上清液干扰素β浓度[(88.67±9.01)pg/ml]与对照组[(137.68±12.28)pg/ml]比较,t=9.653,P<0.01,差异有统计学意义.聚肌胞刺激后24h,HBV组培养液上清液干扰素β浓度[(69.89±5.80)pg/ml]与对照组[(72.25±8.61)pg/ml]比较,差异无统计学意义(P>0.05).聚肌胞刺激小鼠肝脏树突状细胞后P-干扰素调节因子3表达逐渐增强.经HBV干预在感染时病毒与细胞数量的比值为25,24 h后再用聚肌胞刺激2 h,HBV组P-干扰素调节因子3表达较对照组减弱.结论 HBV干预后小鼠肝脏树突状细胞P-干扰素调节因子3及其下游Ⅰ型干扰素表达均下调.

Abstract：

Objective To detect the secretions of type Ⅰ interferon and the expressions of phospho-IRF3 in murine liver dendritic cells intervened by HBV.Methods The murine liver dendritic cells were isolated via anti-CD11c microbeads and were incubated in the presence of GM-CSF and IL-4 to induce the DC generation and proliferation in 24-well cell culture plates.HBV virions were isolated via ultracentrifugation and were detected by quantitative Realtime-PCR.The DCs were divided into two groups:one group was cultured with HBV virions for 24 hours,the other group was cultured without HBV as control group.The cells were harvested at Oh,1h,2h,6h and 24h after being stimulated with poly I:C and the expressions of pIRF3 and the concentration of IFN β in supematants were detected with western blot and ELISA respectively.Results The IFN β concentrations at 0h,6h and 24h in the supernatants of the RBV group and the control group were(12.38±3.71)pg/ml,(88.67±9.01)pg/ml and(69.89±5.80)pg/ml vs(10.83±4.11)pg/ml,(137.68 ± 12.28) pg/ml and (72.25 ± 8.61) pg/ml,respectively. No statistical differences found at 0 h (t =0.8398,P > 0.05) and 24 h (t = 0.6820,P > 0.05) between the two groups except that at 6 h (t = 9.653,P <0.01). The expressions of phospho-IRF3 in HBV group were lower than that in control group. Conclusions The type Ⅰ interferon secretion and the phospho-IRF3 expression were decreased in murine liver dendritic cells when intervened by HBV.     

两种不同方法评估替比夫定治疗慢性乙型肝炎患者肾小球滤过率的变化

目的：两种不同方法评估替比夫定治疗慢性乙型肝炎患者肾小球滤过率的变化。方法回顾性分析2009年9月至2012年9月在复旦大学附属华山医院单用替比夫定600 mg/d 口服治疗的慢性乙型肝炎患者资料。比较基于血清肌酐（Cr）及血清胱抑素 C 计算的肾小球滤过率。统计学处理采用t检验及秩和检验。结果患者共45例,男31例,女14例。患者 Cr 水平在抗病毒治疗前、治疗52周和104周三个时间点分别为（67．00＆#177;12．27）、（62．56＆#177;10．85）、（61．68＆#177;13．31）μmol/L,差异无统计学意义。患者血清胱抑素 C 水平在抗病毒治疗前、治疗52周和104周三个时间点分别为（0．8434＆#177;0．1113）、（0．7927＆#177;0．1204）、（0．7715＆#177;0．0915）mg/L。患者血清胱抑素 C 水平在抗病毒治疗52周和104周均较治疗前下降,差异有统计学意义（t＝2．063,P＝0．0421和t＝3．053,P＝0．0031）。基于血清肌酐计算的肾小球滤过率在抗病毒治疗前、治疗52周和104周三个时间点中位数分别为123．6、123．8、123．7 mL/min/1．73 m2,差异无统计学意义。基于血清胱抑素 C 计算的肾小球滤过率在抗病毒治疗前、52周和104周三个时间点分别为 （107．3＆#177;15．8）、（113．6＆#177;18．7）、（115．1＆#177;13．8）mL/min/1．73 m2,基于血清胱抑素 C 计算的肾小球滤过率在104周较治疗前升高,差异有统计学意义（t＝2．284,P＝0．0252）。结论在使用替比夫定治疗慢性乙型肝炎的患者中,肾小球滤过率有改善,基于血清胱抑素 C 计算的肾小球滤过率较基于血清肌酐计算的肾小球滤过率更加敏感。     

角鲨烯环氧化酶对卵巢癌细胞生物学行为的影响及其机制探讨

目的:观察角鲨烯环氧化酶（squalene epoxidase,SQLE）对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响,并从上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)方向探究其可能的机制。方法:通过搜索GEPIA和Western blotting、qRT-PCR确定SQLE是否存在差异表达;Kaplan-Meier Plotter在线网站评估SQLE与卵巢癌预后的关系;构建稳定敲减SQLE的A2780细胞株和稳定过表达SQLE的ES-2细胞株,Western blotting、qRT-PCR检测敲减和过表达效率;MTT和集落克隆实验、划痕实验及Transwell小室分别用于检测细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化;流式细胞术检测凋亡变化;Western blotting检测Ki67、EMT、凋亡、Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达。结果:SQLE在卵巢癌组织和细胞中表达水平明显高于正常卵巢组织和细胞(P＜0.05);SQLE表达水平与卵巢癌预后明显相关(P＜0.05);敲减SQLE后细胞增殖、迁移及侵袭能力减弱(P＜0.05)、细胞凋亡增加(P＜0.05),并导致Ki67、EMT、凋亡以及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的变化(P＜0.05),过表达SQLE时趋势则相反;XAV-939可逆转过表达SQLE的ES-2细胞中相关蛋白表达水平的变化。结论:SQLE可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路增强卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,抑制其凋亡,并促进上皮间质转化。     

检测 GPC3和 GP73两种方法的比较及与临床的相关性

采用 ELISA 法检测70例标本(肝癌组39例、肝硬化组31例)血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)和高尔基体蛋白73(GP73)的水平,qRT-PCR 法检测相同标本外周血单个核细胞(PBMC)中 GPC3 mRNA 和 GP73 mRNA 的相对表达量。结果显示肝癌组血清中 GPC3和 GP73表达量显著高于肝硬化组(P <0．0001);两组间 PBMC 中 GPC3 mRNA 和GP73 mRNA 水平差异无统计学意义;相关性分析结果显示,肝硬化组和肝癌组血清中 GPC3、GP73含量均有正相关性(P <0．01)。血清中 GPC3和 GP73的水平均能预测原发性肝癌,且 GPC3和 GP73的水平具有一定的相关性;PBMC 中GPC3 mRNA 和 GP73 mRNA 的表达水平不能很好的区分肝癌组与肝硬化组,提示 ELISA 法检测血清中 GPC3和 GP73的表达水平是临床预测原发性肝癌的首选方法。     

慢性乙型重型肝炎患者外周血树突状细胞核因子-κB及其激活因子的表达及意义

目的 探讨慢性乙型重型肝炎(CSHB)患者外周血单个核细胞衍生的树突状细胞核因子(NF)-κB、肿瘤坏死因子(TNF)α、白细胞介素(IL)-6与疾病严重程度及预后的相关性.方法 采集37例CSHB患者、20例慢性乙型肝炎(CHB)患者和20例健康对照者的外周血,分为CSHB组、CHB组与对照组并分别用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,用免疫磁珠细胞分选法获得纯化的单核细胞,体外培养6 d为未成熟的树突状细胞,用聚肌胞刺激48 h为成熟的树突状细胞(mDC).用实时定量PCR检测mDC NF-κB p50表达;用酶联免疫吸附试验测定培养mDC上清液中TNF α、IL-6的分泌水平.两组间比较采用t检验,3组间比较采用One-Way ANOVA分析法,相关分析采用直线相关分析法.结果 3组研究对象mDC表达NF-κB p50,表达量CSHB组为2.63±0.94、CHB组为2.03±0.39、对照组为1.41±0.40,3组比较,F=19.01,P<0.01,差异有统计学意义.mDC分泌TNF α,CSHB组、CHB组、对照组分别为(15 317.69±4124.90)pg/ml、(9670.29±3654.68)pg/ml、(6547.43±1027.20)pg/ml,3组比较,F=45.77,P<0.01,差异有统计学意义; IL-6分泌量分别为(1423.78±375.14)pg/ml、(862.68±93.68)pg/ml、(567.26±167.04)pg/ml,3组比较,F=67.60,P<0.01,差异有统计学意义.3组研究对象mDCNF-κB p50表达与TNF α、IL-6水平呈正相关(r=0.52,P<0.01;r=0.65,P<0.01).CSHB组mDC表达TNF α、IL-6与凝血酶原活动度呈负相关(r=-0.41,P=0.01;r=-0.40,P=0.01),与ALT、总胆红素、HBV DNA无相关性(r=-0.03,P=0.85,r=0.01,P=0.93,r=0.01,P=0.95;r=-0.09,P=0.58,r=0.16,P=0.34,r=0.09,P=0.59).CSHB 存活组与死亡组mDC表达TNF α、IL-6差异无统计学意义(t=0.42,P=0.67;t=0.76,P=0.45).结论 CSHB患者树突状细胞衍生的NF-κB及其激活产物TNF α、IL-6表达增加,可能与CSHB疾病严重程度相关.     

乙型肝炎病毒抑制巨噬细胞TLR3、Mda-5和RIG-I表达

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）与巨噬细胞上模式识别受体（PRR）的相互作用。方法以不同载量HBV刺激佛波酯（PMA）诱导的单核源巨噬细胞,实时定量PCR检测刺激2、4、12及24h后巨噬细胞Toll样受体3（TLR3）、黑色素瘤分化相关基因5（Mda-5）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）表达;以poly I：C刺激与HBV共培养12h的巨噬细胞,酶联免疫吸附试验（ELISA）测定poly I：C刺激4h后培养上清液中β干扰素（IFNβ-）的分泌水平。结果不同病毒载量组巨噬细胞TLR3表达在2、4、12、24h较对照组下调,且高病毒载量组表达低于低病毒载量组（F值分别为123.64、24.50、6.69、7.61,P均〈0.01）;Mda-5和RIG-I在上述4个时间点的表达为高病毒载量组低于低病毒载量组（F值分别为36.44、48.58、46.59、12.77;67.68、74.54、18.18、17.76;P均〈0.01）。IFNβ-的表达为：阳性对照组〉低病毒载量组〉高病毒载量组〉阴性对照组（F=78.42,P〈0.01）,表达量分别为（497.2±43.7）、（294.2±48.4）、（92.5±12.3）、（40.4±9.9）pg/mL。结论 HBV能抑制巨噬细胞TLR3、Mda-5和RIG-I表达,致IFN-β分泌下降,可能是其逃逸机体天然免疫的机制之一。     

聚乙二醇干扰素治疗慢性乙型肝炎患者血清干扰素浓度及其抗体水平的变化

目的探讨聚乙二醇干扰素α2a治疗慢性乙型肝炎(CHB)患者血清干扰素浓度和干扰素抗体水平的变化,以及其对疗效的影响。方法 41例CHB患者皮下注射聚乙二醇干扰素α2a(派罗欣,罗氏公司)180μg,每周1次,在0、4、12、24和48周时用ELISA法检测干扰素浓度和干扰素抗体水平,并在停药后24周检测干扰素浓度。结果干扰素浓度在0、4、12、24、48周和停药24周时分别为22.9(3.1～45.8)pg/mL、2734(9.2～4224)pg/mL、4025(269～4462)pg/mL、3884(14.5～4567)pg/mL、3978(76.9～5227)pg/mL和62.1(52.3～74.6)pg/mL。干扰素浓度在4、12、24、48周和停药24周与0周相比,差异有统计学意义(t=9.481,P<0.01;Z=-6.862,P<0.01;Z=-6.969,P<0.01;Z=-6.477,P<0.01;Z=-4.204,P<0.01);12、24与4周相比,差异有统计学意义(Z=-4.316,P<0.01;Z=-3.830,P=0.0001);24周与12周相比,差异无统计学意义(Z=0.367,P=0.7136)。干扰素抗体水平在4、12、24、48与0周相比,差异无统计学意义(Z=-1.035,P=0.3007;Z=0.101,P=0.9192;Z=0.158,P=0.8748;Z=1.779,P=0.0752)。结论聚乙二醇干扰素α2a治疗过程中,患者血清干扰素浓度在12周达到稳定浓度,停药24周血清干扰素浓度仍略高于治疗前,而干扰素抗体浓度变化不大,二者无明显相关性。     

血清磷酯酰肌醇蛋白聚糖3与高尔基体蛋白73检测在肝细胞癌诊断中的意义

目的：评价血清磷酯酰肌醇蛋白聚糖3（gpc3）和高尔基体蛋白73（gp73）的检测对肝细胞癌（HCC）的筛查作用。方法采集70例 HCC 癌及肝硬化（肝脏再生结节）患者基线时外周血。应用 ELISA 法检测患者血清 gpc3和gp73,并与其血清AFP水平做对照。结果 HCC组gpc3、gp73测量值显著高于肝硬化组（P＜0．01）;gpc3诊断HCC的截断值＞9．3μg/L,AUC＝0．956,灵敏度为89．74％,特异度为96．77％,阳性预测值为97．2％,阴性预测值为88．2％,约登指数为0．8652,阳性似然比27．82,阴性似然比0．11,gp73诊断 HCC 的截断值＞77．68μg/L,AUC＝0．937,灵敏度为92．31％,特异度为83．87％,阳性预测值为87．8％,阴性预测值为89．7％,约登指数0．7618,阳性似然比5．72,阴性似然比0．092。结论血清gpc3与gp73水平可用于 HCC的筛查。     

慢加急性肝衰竭患者Toll样受体3触发后DC分泌细胞因子的变化

目的探讨慢加急性肝衰竭（ACLF）患者外周血单核细胞衍生的树突状细胞（MoDC）上TLR3触发后细胞因子的分泌情况。方法选择ACLF患者60例,慢性乙型肝炎（CHB）患者40例,20例健康者作对照组（NC组）,取其抗凝全血,通过密度梯度法离心及免疫磁珠阳性选择法分离单核细胞,体外诱导培养为MoDC,经poly（I︰C）刺激后,实时荧光定量PCR检测TLR3及核因子κB和干扰素调节因子3的表达,液相蛋白流式检测促炎性因子IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-1β和TNF-α的分泌水平,均数间两两比较采用t检验。结果 poly（I︰C）刺激后,ACLF组患者NF-κBmRNA显著高于CHB组和NC组（P〈0.01）,而其IRF3mRNA低于CHB和NC组（P〈0.01）。3组研究对象MoDC分泌的IL-6及TNF-α差异有统计学意义（P〈0.005）,其分泌水平为ACLF组〉CHB组〉NC组。分泌的IL-10在ACLF组低于CHB组（P=0.021）,但与NC组差异无统计学意义。IL-12p70的分泌水平在ACLF组显著低于CHB组和NC组（P〈0.001）。IL-8分泌水平为ACLF组