6种黄连生物碱对鼠肝微粒体UGTs及UGT1A1活性影响的体内外研究

为探讨黄连与其他药物代谢性相互作用的机制,对6种黄连生物碱与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)及UGT1A1的相互作用进行了考察。采用大小鼠肝微粒体,以及生物碱小鼠体内诱导后的肝微粒体,构建微粒体体外孵育模型,以4-硝基酚(4-NP)为底物检测UGTs活性,β-雌二醇为底物检测UGT1A1活性,利用UV和HPLC测定底物或代谢物含量。结果,在大鼠体外实验中,小檗碱、表小檗碱、黄连碱及药根碱均能显著抑制UGTs活性,其中表小檗碱抑制作用最强;对UGT1A1,药根碱表现为弱的抑制作用(IC50≈227μmol·L-1),而黄连碱和巴马汀则呈显著的激活作用。小鼠体外实验中,小檗碱、黄连碱、药根碱和巴马汀对UGTs均呈显著的抑制作用;而6种生物碱对UGT1A1均表现为显著的激活作用。小鼠体内诱导实验中,只有小檗碱对UGTs,药根碱对UGT1A1活性呈现显著升高作用,其他生物碱的作用不明显。综上,黄连生物碱在对UGT的作用上显示出明显的种属和体内外的差异,同时生物碱结构的变化对UGT活性也会产生较大的影响,这种影响可能是黄连与其他药物发生代谢性相互作用的原因之一。     

芫花氯仿萃取物对大鼠及人肝微粒体UGTs及UGT1A1活性影响

考察芫花氯仿萃取物对尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)及UGT1A1活性的影响,为预测芫花致肝损伤可能发生机制提供实验依据。采用体外肝微粒体孵育模型,分别以4-硝基酚和β-雌二醇为底物检测UGTs及UGT1A1活性;利用UV和HPLC测定底物或代谢物含量。结果表明,HPLC测得氯仿萃取物中3种黄酮类成分芹菜素、羟基芫花素和芫花素质量分数分别为1.00%,6.40%,18.38%;UV法测得总二萜质量分数为37.39%。与空白组相比,在大鼠肝微粒体(RLM)孵育体系,氯仿萃取物能显著抑制UGTs活性,而在人肝微粒体(HLM)孵育体系,抑制作用不明显;对UGT1A1,在RLM和HLM孵育体系中,氯仿萃取物均表现为中等强度的抑制作用(以芫花素计,IC50=8.76,10.36μmol·L-1);抑制类型分别为非竞争性抑制和反竞争性抑制。综上,氯仿萃取物对UGTs及UGT1A1活性均可产生抑制作用且存在种属差异性,推测这种抑制作用可能是芫花致肝损伤的机制之一。     

羟基芫花素对UGTs及UGT1A1活性抑制作用种属差异的体外研究

考察羟基芫花素对尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)及UGT1A1活性的影响,为预测其与其他药物的代谢性相互作用提供理论借鉴。该实验采用体外肝微粒体孵育模型,以4-硝基酚(4-NP)为底物检测UGTs活性;β-雌二醇为底物检测UGT1A1活性,利用UV和HPLC测定底物或代谢物含量。结果表明,在大鼠、小鼠和人肝微粒体(HLM)孵育体系,羟基芫花素能显著抑制UGTs活性;对UGT1A1,在小鼠肝微粒体(MLM)孵育体系中,羟基芫花素几乎无抑制作用(IC50=190μmol·L-1);在大鼠肝微粒体(RLM)和重组酶(r UGT1A1)孵育体系中,羟基芫花素表现为中等强度的抑制作用(IC50=10.93,20.07μmol·L-1),抑制类型分别为竞争性抑制和线性混合型抑制;在HLM孵育体系中,羟基芫花素表现为弱抑制作用(IC50=76.31μmol·L-1),抑制类型为竞争性抑制;其抑制强弱顺序为RLMr UGT1A1HLMMLM。综上,羟基芫花素对不同肝微粒体孵育体系中UGTs及UGT1A1活性均可产生抑制作用且存在种属差异性,提示羟基芫花素可能存在基于UGT1A1酶的药物相互作用。该研究可为合理开发利用羟基芫花素提供实验依据,并为研究药物在临床上的联合用药提供理论借鉴。     

芫花主要黄酮成分对肝微粒体UGTs及UGT1A1活性的体外抑制作用

目的 考察芫花主要黄酮成分芫花素和芹菜素对尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）及UGT1A1活性的影响。方法 采用体外肝微粒体孵育模型,以4-硝基酚（4-nitrophenol,4-NP）为底物检测UGTs活性,胆红素为底物检测UGT1A1活性;利用UV及UPLC-MS/MS测定底物或代谢产物的含量。结果 对UGTs,在大鼠肝微粒体、小鼠肝微粒体以及人肝微粒体孵育体系中,芫花素和芹菜素均能不同程度地抑制UTGs活性;抑制强弱顺序：在大鼠肝微粒体温孵体系中,芫花素>芹菜素;在小鼠肝微粒体以及人肝微粒体温孵体系中,芹菜素>芫花素。对UGT1A1,在人肝微粒体孵育体系中,芫花素和芹菜素均表现为中等强度的竞争性抑制作用,抑制强弱顺序：芹菜素（IC₅₀=12.40 μmol·L^-1）>芫花素（IC₅₀=23.21 μmol·L^-1）。结论 芫花素和芹菜素对不同肝微粒体孵育体系中UGTs及UGT1A1均可产生显著抑制作用且存在种属差异。芫花素及芹菜素可能存在基于UGT酶的药物相互作用。     

HPLC-MS/MS法鉴定黄连碱在糖尿病大鼠尿液、粪便、胆汁中的代谢产物＊

目的 黄连碱是黄连中一种主要的异喹啉类生物碱，具有较好的抗糖尿病药理活性。探讨黄连碱在正常和糖尿病大鼠体内的代谢产物及其代谢途径是否存在差异。方法 本实验采用SD大鼠禁食12 h后腹腔注射链脲佐菌素（STZ）制备糖尿病大鼠模型。造模成功后分别单次灌胃正常和糖尿病大鼠黄连碱（剂量20 mg/kg），收集给药后0~48 h的尿液和粪便以及0~36 h的胆汁样品，采用高分辨HPLC-MS/MS技术对生物样品中的药物原型及代谢物进行鉴定。选用Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL·min^-1，柱温25℃。质谱使用电喷雾离子源（ESI），正、负离子检测模式，扫描范围m/z 50~700。对各色谱峰质谱图进行分析，根据准分子离子峰判断相对分子质量，进一步根据各色谱峰的主要碎片离子、保留时间等信息以及相关文献数据，推测化合物的结构。结果 黄连碱在正常和糖尿病大鼠体内可发生较广泛的Ⅰ相和Ⅱ相代谢，在大鼠尿液、粪便、胆汁共鉴定出14个代谢产物，其中尿液10中个、粪便中11个、胆汁中8个；Ⅰ相代谢物5个，主要为羟基化物和去甲基化物，Ⅱ相代谢物9个，主要为葡萄糖醛酸化物，但由COP脱氢后生成的M1再次硫酸酯化的产物M4在糖尿病大鼠胆汁中未检出。结论 本课题组推测M1在糖尿病和正常大鼠胆汁中代谢过程的差异是黄连碱产生降糖作用的关键，但其他代谢产物量上的差异有待进一步研究确定。本研究为黄连碱的药效学和药理学研究提供一定的物质基础。     

HPLC-MS/MS分析黄连碱在大鼠体内外的代谢产物

目的:探讨黄连碱的体内外代谢产物及其代谢途径。方法:体内代谢采用单次灌胃大鼠黄连碱(剂量25 mg·kg~(-1)),收集给药后0～48 h的尿液和粪便,0～24 h的胆汁以及给药0. 25,1,2 h后的血浆和脑组织样品;体外代谢采用大鼠肝微粒体及肠道菌群孵育的方法;运用高分辨HPLC-MS/MS技术对生物样品中的药物原型及代谢物进行鉴定。选用ZORBAX SB-C_(18)色谱柱(4. 6 mm×150 mm,5μm),以乙腈-0. 1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱,流速1. 0 mL·min~(-1),柱温25℃。质谱使用电喷雾离子源(ESI),正、负离子检测模式,扫描范围m/z 50～1 200。对各色谱峰质谱图进行分析,根据准分子离子峰判断相对分子质量,进一步根据各色谱峰的主要碎片离子、保留时间等信息,与文献数据进行比较,推测化合物的结构。结果:在大鼠尿液、粪便、胆汁、血浆、脑组织、肝微粒体温孵和肠道菌群温孵样品中发现了黄连碱的17个代谢产物,Ⅰ相代谢产物11个,Ⅱ相代谢产物6个。这17个代谢产物是黄连碱在大鼠体内羟基化、去甲基化和脱氢作用、硫酸酯化、葡糖糖醛酸化后产生的。结论:黄连碱可在大鼠体内发生Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应,代谢物主要存在于尿液中,主要代谢部位为肝脏;黄连碱胃肠道吸收较差,代谢少,大部分经粪便以原型排泄,为黄连碱的药效学和药理学研究提供了一定的物质基础。