T4 DNA连接酶介导的5'RACE法克隆大鼠Nor1全长cDNA

目的:克隆75AEST全长cDNA序列。方法:抽提在25mmol/LKCl条件下培养7d的大鼠小脑颗粒神经元的总RNA后,用DNA连接酶介导的5'RACE法克隆75A表达序列标签(EST)cDNA5'端未知序列,其产物亚克隆到pGEM-Teasy后进行序列测定以及同源性分性。结果:首轮5'RACE扩增出2.5kb序列后,75AEST鉴定为神经来源孤儿受体1(Nor1)基因的部分序列;再经过二次轮5'RACE,我们首次克隆Nor-1的全长cDNA序列。结论:T₄DNA连接酶介导的5'RACE是一种效率较高的克隆mRNA5'端未知序列的好方法,为进一步研究Nor1在小脑颗粒神经元存活或分化过程中的作用奠定基础。     

小脑颗粒神经元凋亡差异表达基因的分离克隆研究

目的筛选分离低钾诱导的小脑颗粒细胞凋亡的差异表达基因。方法采用低钾处理的小脑颗粒细胞,抽提细胞总RNA,用荧光法mRNA差异显示技术分离差异表达基因,并对差异表达基因片段进行回收、克隆,经反向RNA印迹及RT鄄PCR技术验证。结果发现51条差异片段,成功克隆8个片段,其中2个未知功能的基因片段证实在低钾诱导的小脑颗粒细胞凋亡中表达增加。结论mRNA差异显示法是分离差异表达基因的一个良好的工具,分离出的差异基因与神经细胞凋亡有关。     

大鼠神经元Arnt2基因cDNA序列的分析

目的 克隆并分析神经元凋亡差异表达5号EST全长cDNA。方法 以大鼠大脑Marathon Ready cDNA为模板，采用SMART RACE技术克隆神经元凋亡差异表达5号EST全长cDNA，产物亚克隆刘pGEM-T easy质粒载体后进行序列测定以及同源性分析。结果 经过3次5’RACE扩增，得到的5号EST cDNA长度为5663bp，其中包含1个2136bp的完整的开放读码框序列，与已知大鼠基因芳香烃受体核转位因子2（Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator2，Arnt2）完全同源：该cDNA 3’瑞非编码区长达3323bp，包含3个AATAAA加尾信号和1个由12个腺嘌呤核苷酸组成的polyA序列。结论 5号EST目标基因为大鼠基因Arnt2，该基因3’端完整的非编码区cDNA序列为首次报道。神经元凋亡差异表达基因Arnt2的克隆鉴定为深入研究小脑颗粒神经元低钾性凋亡机制奠定了基础。     

胞内钙离子浓度与咖啡因保护小脑颗粒神经元作用的关系

用凝胶电泳和fura-2荧光技术测定［Ca²⁺］_i方法研究咖啡因对低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的保护作用与［Ca²⁺］_i升高之间的关系. 将体外培养的小脑颗粒神经元从高钾（25 mmol·L^-1 KCl）培养基中转移到低钾（5 mmol·L^-1 KCl）培养基中,神经元发生凋亡. 但低钾引起的神经元死亡可被咖啡因（5-20 mmol·L^-1）浓度依赖性地保护,且咖啡因的这种作用不受蓝尼定(ryanodine) 敏感钙释放阻断剂蓝尼定和丹曲林(dantrolene)的影响;也不被Ｌ-型钙通道阻断剂硝苯地平, 尼莫地平, 维拉帕米和NMDA受体阻断剂地佐环平抑制. 结果说明［Ca²⁺］_i的升高并不是咖啡因对小脑颗粒神经元的保护作用所必需的.     

黑海参多糖对β-淀粉样蛋白诱导的皮质神经元凋亡的保护作用

体外培养大鼠皮质神经元,用β－淀粉样蛋白（β－ＡＰ）诱导皮质神经元凋亡。黑海参多糖使皮质神经元存沃经增加,使神经元的ＤＮＡ电泳图谱不出现“梯子状”,使神经元的流式细胞仪分析图上不出现凋亡峰,表明黑海参多糖对β－ＡＰ诱导的皮质神经地凋亡具有保护作用。     

普卡霉素对大鼠小脑颗粒神经元低钾性凋亡的抑制作用(英文)

目的观察普卡霉素对大鼠小脑颗粒神经元低钾性凋亡的保护作用。方法建立大鼠小脑颗粒神经元低钾性凋亡模型,采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记,Hoechst 33258核染色,琼脂糖凝胶电泳以及醋酸荧光素染色等方法,根据细胞凋亡的形态学及生物化学等特征,分析普卡霉素对大鼠小脑颗粒神经元低钾性凋亡的影响。结果大鼠小脑颗粒神经元与普卡霉素预孵育1 h及持续作用下,普卡霉素浓度依赖性地抑制低钾诱导24 h所致的大鼠小脑颗粒神经元凋亡,其有效浓度在50~200 nmol.L-1之间,普卡霉素浓度为200nmol.L-1时达到的最大凋亡抑制率约为80%。结论普卡霉素对大鼠小脑颗粒神经元低钾性凋亡具有较强的抑制作用。     

氨甲酰胆碱对多巴胺诱导的小脑颗粒细胞凋亡的保护机制

【目的】研究多巴胺诱导小脑颗粒神经元凋亡的分子机制,以及胆碱受体激动剂氨甲酰胆碱对多巴胺诱导凋亡的作用。【方法】在培养的小脑颗粒神经元建立多巴胺凋亡模型。用相差显微镜观察形态学,DNA凝胶电泳和Hoechst33258核染色分析神经元凋亡,细胞的存活率用二乙酸荧光素（FDA）染色法检测。采用Westernblot分析细胞外信号调控的蛋白激酶（ERK）激活情况。【结果】多巴胺可诱导小脑颗粒神经元凋亡,并可持续激活ERK,二者均可被氨甲酰胆碱和PD98059抑制。氨甲酰胆碱对神经元的保护作用及对ERK激活的抑制作用可被阿托品阻断。【结论】多巴胺在小脑颗粒神经元诱导凋亡可能是通过持续激活ERK介导的。氨甲酰胆碱通过激活M胆碱受体,继而抑制了ERK的激活,从而起到对神经元的保护作用。