血管紧张素Ⅱ对肝癌细胞系 HEPG2发生上皮间质转化的影响

目的：通过血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激肝癌细胞系HEPG2,探讨其是否可以促进HEPG2发生上皮间质转化（ EMT）。方法使用AngⅡ刺激HEPG2,进而采用蛋白印记法对HEPG2中Vimentin 和 E－cadherin 蛋白表达水平进行检测;探讨其发生EMT的合适时间;并使用AngⅡ的抑制剂Ang1－7和Ang1－7的抑制剂A779进行干预,明确AngⅡ诱导HEPG2发生EMT的作用。结果 AngⅡ刺激下,HEPG2中E－cadherin 转录水平下降,Vimentin转录水平升高;最适宜刺激时间是48 h。 AngⅡ诱导HEPG2发生EMT的作用可部分被抑制剂Ang1－7抑制。结论 AngⅡ刺激下,HEPG2可以发生EMT。     

LIN28A和LAMP1在膀胱癌细胞系中的表达及意义

目的:探讨LIN28A和LAMP1在膀胱癌细胞系中表达情况,以及两者之间的关系,推测其可能临床意义及对肿瘤进展的影响。方法:采用RT-PCR检测膀胱癌细胞系LIN28A、LIN28B和LAMP1表达,免疫荧光检测LIN28A和LAMP1二者蛋白表达定位;LIN28A敲减后通过qRT-PCR检测LAMP1的mRNA表达变化。结果:5个癌细胞系T24、UM-UC3、J82、5637和SW780和正常移行上皮细胞系SV-HUC-1均表达LIN28A,其中J82也表达LIN28B;5个癌细胞系均表达LAMP1,SV-HUC-1不表达LAMP1;LIN28A和LAMP1蛋白均定位在胞浆;LIN28A敲减后对LAMP1的mRNA表达变化无明显影响,相应蛋白变化需要进一步验证。结论:4个膀胱癌细胞系T24、5637、UM-UC3和SW780可以用于LIN28A与肿瘤相关的机制研究,而J82可用于LIN28B的机制研究。LIN28A对肿瘤细胞和干细胞的调控方面可能具有相似性,敲减后对其靶点mRNA表达量无明显影响,LAMP1蛋白可能对肿瘤细胞侵袭转移具有抑制作用。     

从我国儿童呼吸道标本中首次检出人博卡病毒

目的 调查国内儿童急性呼吸道感染中是否存在人类博卡病毒（human Boeavirus）感染。方法 采用聚合酶链反应（PCR）技术对湖南地区急性呼吸道感染儿童的鼻咽抽吸物（NPA）进行包括HBoV等12种病毒基因筛查，然后将PCR扩增阳性产物构建到Ppbs-T载体进行TA克隆及步移法测序，获取全长cDNA，登录Gen Bank作对比研究。结果 从某儿童急性肺炎的呼吸道标本中，检获到HBoV基因，该患者11种常见呼吸道病毒PCR均为阴性，唯检出HBoV。患者表现咳嗽、低热、呼吸困难等临床症状，在儿科诊断为肺炎。结论 国内儿童急性呼吸道感染中，特别是在中国南方地区的急性呼吸道感染患儿中，有部分可能系HBoV感染引起，应引起临床医护人员重视。     

Stra8基因启动子逆转录病毒包装细胞株的建立

目的:建立小鼠Stra8基因启动子控制绿色荧光蛋白EGFP表达(P(stra8)-EGFP)的逆转录病毒包装细胞株,以方便地将P(stra8)-EGFP转导到目的细胞,为生殖细胞鉴定分选提供基础.方法:PCR扩增小鼠基因组DNA中的Stra8基因启动子片段,构建Stra8基因启动子控制表达的EGFP报告基因逆转录病毒质粒.将质粒脂质体法转染PT67病毒包装细胞,G418抗性筛选后,梯度稀释法将包装细胞单克隆化并扩增成多个细胞株.以包装细胞培养上清液感染NIH3T3细胞的所形成的G418抗性阳性细胞数定义病毒滴度,确定高滴度病毒包装细胞株.通过染毒小鼠骨髓间充质干细胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)验证该细胞株的P(stra8)-EGFP转导效果.结果:所建立的病毒包装细胞株培养上清液滴度达到1.3×10(6) cfu/ml.MSC经包装细胞培养上清液感染后,在(retinoic acid,RA)诱导下能表达EGFP蛋白.结论:成功构建了将P(stra8)-EGFP转导到目的细胞的PT67逆转录病毒包装细胞株.     

厚朴酚与和厚朴酚抗鼻咽癌作用机制研究

目的探讨厚朴中小分子化合物厚朴酚与和厚朴酚对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响。方法分别采用MTT比色法、细胞划痕实验、Transwell实验,观察厚朴酚与和厚朴酚对鼻咽癌细胞HONE1增殖、迁移、侵袭的影响。结果厚朴酚与和厚朴酚对鼻咽癌细胞HONE1有较显著的抑制增殖、迁移和侵袭效应,而且这种效应呈显著的剂量依赖性。结论厚朴酚与和厚朴酚能够抑制鼻咽癌肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,厚朴酚与和厚朴酚是具有开发潜力的抗癌小分子化合物。     

不同基质蛋白对小鼠胚胎干细胞生殖细胞分化相关基因表达的影响

目的:探讨不同基质蛋白对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)分化形成拟胚体(embry-oid bodies,EBs)后生殖细胞分化相关基因表达的影响及机制。方法:mESCs分化形成EBs 3 d后接种于不同基质蛋白包被的培养皿中,包括人工基底膜(matrigel,M组)、纤维连接蛋白(fibronectin,F组)、层粘蛋白(laminin,L组)、胶原(collagen,C组)和非生物活性底物琼脂糖(agarose,A组),同时设不加任何基质蛋白的空白对照组(B组)。RT-PCR检测EBs在不同基质蛋白上d1～d4期间生殖细胞分化相关基因的表达,以及mESCs内源性基质蛋白FN(fibronectin)、LN(laminin)以及整合素受体β1基因的表达。结果:L组和F组EBs易贴壁分化,RT-PCR结果也证实原始生殖细胞(PGCs)分化基因Blimp-1、Stella、Mvh和减数分裂启动基因Stra8在L组和F组表达总体趋势为逐渐增强;M组和C组的表达趋势不明显;A组基因表达水平整体偏低;空白对照B组基因表达水平整体偏高但均呈下降趋势。L组和空白对照组细胞表达内源性基质蛋白FN、LN以及整合素受体β1。结论:层粘蛋白/β1信号途径可能对mESCs向PGCs分化具有指导作用,外源性层粘蛋白可能通过其受体β1亚单位传递诱导信号,调节mESCs来源的EBs向PGCs分化,FN可能通过其他整合素受体亚单位发挥作用。无任何外源性基质蛋白时,自身分泌的内源性基质蛋白也促进细胞分化。     

中国湖南地区人偏肺病毒的基因分型及其膜蛋白G基因特征的分析

目的 研究中国湖南地区人偏肺病毒(hMPV)的基因分型及其膜蛋白G序列的遗传学特征,比较分析其区域性流行特点.方法收集2005年中国湖南地区232份住院儿童鼻咽抽吸物(NPA)样本进行常见呼吸道病毒筛查,并扩增hMPV阳性样本的膜蛋白G全序列,与GenBank中已知hMPV参考株及其他地区公布的相关资料进行比对、进化等分子遗传学特征分析.结果从232份临床样本中共检测得到17份(7.3%)hMPV阳性样本,与其他病毒混合感染率达35%.扩增出其中13份hMPV样本的G蛋白全序列,分属于4种亚型(A1、A2、B1、B2).核酸长度类型有4种(711,675,660,696nt),N-连接糖基化位点数目和位置、半胱氨酸残基数目等特征与已报道的同期北京地区、日本、北美等地区hMPV调查分析结果不尽一致.结论中国湖南地区与其他地区同期hMPV调查分析结果各有特点,反映出hMPV变异显著,具有明显的地区流行特征.     

诱导小鼠骨髓间充质干细胞向雄性生殖细胞的定向分化

目的探讨小鼠骨髓间充质干细胞是否能够在体外被诱导发生向雄性生殖细胞方向的分化。方法从雄性小鼠骨髓中分离能够长期贴壁生长的细胞,并鉴定其是否为间充质干细胞。对分离的细胞进行生殖细胞特异性报告基因标记(stra-8-GFP)。采用视黄酸诱导标记的细胞发生向生殖细胞方向的分化。通过观察报告基因表达和生殖细胞相关基因mRNA表达情况确定是否发生了分化。结果从小鼠骨髓中分离到的贴壁生长的细胞表达间充质干细胞的表面标志CD90、CD44、CD105和Sca-1;细胞在体外可以被诱导分化为成骨、成软骨及成脂肪细胞。报告基因标记的间充质干细胞在被视黄酸诱导2d后开始表达绿色荧光蛋白和生殖细胞相关基因Mvh、Fragilis和Stella的mRNA。未经视黄酸诱导的细胞不表达绿色荧光蛋白和生殖细胞相关基因。结论小鼠骨髓间充质干细胞在体外可以被视黄酸诱导发生向雄性生殖细胞方向的分化。     

miRNA-138与EZH2在肾透明细胞癌发生发展中作用机制的研究

目的:探讨miRNA-138及其调控靶基因EZH2在肾透明细胞癌(RCC)发生发展中的相关作用机制。方法:利用第二代大规模平行测序技术对10例RCC及对应癌旁组织进行全基因组测序,在肾癌组织中筛选出表达显著上调的miRNA-138;其次在人肾癌细胞株786-O、ACHN、Caki-1、769-P、os-rc-2及对照细胞人胚肾细胞293T中对miRNA-138进行转染,采用划痕实验检测miRNA-138对细胞株侵袭和迁移能力的影响;进而用多种预测软件预测靶基因,对预测的候选靶基因EZH2进行PCR验证。结果:发现miRNA-138在RCC中表达上调,并能够显著促进人肾癌细胞株786-O、ACHN的迁移;而其候选靶基因EZH2的表达在临床组织标本中显著上调;相应蛋白变化需要进一步验证。结论:EZH2表达在RCC中明显高于正常组织,提示EZH2可能是RCC一个敏感的生物学标志。推测miRNA-138与其靶基因EZH2可能参与肿瘤代谢和细胞凋亡等信号通路,在RCC的发生发展中发挥重要作用。     

PcG蛋白EZH2在全反式维甲酸诱导的小鼠iPS细胞系分化过程中的作用

目的探讨组蛋白甲基转移酶EZH2在小鼠iPS细胞系IP14D-1向生殖细胞分化过程中的作用。方法将小鼠iPS细胞系IP14D-1通过悬浮培养分化形成拟胚体(iEBs)作为向生殖细胞分化的启动步骤,1μmol/L全反式维甲酸(atRA)持续诱导iEBs 2、4和7 d,采用实时RT-PCR、荧光定量RT-PCR、免疫荧光检测atRA处理前后EZH2和生殖细胞分化标志性基因Stra8在iEBs中的表达。结果在atRA诱导IP14D-1来源的iEBs中,EZH2表达在诱导后2 d达到高峰,伴随atRA诱导,EZH2表达减弱;而生殖细胞分化标志性基因Stra8其变化特点与EZH2相反,无atRA诱导时EBs表达Stra8较弱,伴随atRA诱导,Stra8表达增强。EZH2和Stra8阳性信号分别定位于胞膜和胞质,其变化特点与PT-PCP结果相一致。结论 atRA诱导使EZH2低水平表达时期提前出现,伴随Stra8增强表达,启动了小鼠iPS细胞向生殖细胞的分化进程。