建立体外血脑脊液屏障模型方法学研究

目的：采用原代分离培养Sprague-Dawley（SD）大鼠脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMECs）和星形胶质细胞（astrocyte,As）建立相对简单可靠、重复性好、接近在体状态的体外血脑脊液屏障（blood-cerebrospinal fluid barrier,blood-CSF barrier）模型。方法：原代分离、纯化和培养BMECs 和As,通过细胞形态学和免疫细胞化学染色方法鉴定原代培养的细胞;通过培养在具有特殊质材和孔径的Transwell 小室上建立体外血脑脊液屏障实验模型,采用倒置显微镜观察细胞形态结构,经跨内皮电阻值（trans endothelialelectrical resistance,TEER）、4 h 液面试漏实验、两种特征性酶检测、荧光素钠通透性（sodium fluorescent,Na-FLU）评价模型的屏障功能。结果：原代培养的BMECs 具有典型的“铺路石”样外观,Ⅷ因子鉴定细胞纯度在95% 以上;As 有细长突触,胞质较浅,胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein,GFAP）鉴定细胞纯度在95% 以上。通过测定TEER 值共培养模型组显示高电阻值（378.97±11.38） Ω·cm2;4 h 液面试漏试验阳性;γ- 谷氨酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase,γ-GT）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）表达分别为（30.88±2.87） μmol·min-1·mL-1 和（2.51±0.88）金氏单位·100 mL-1;Na-FLU 跨膜渗透系数（2.228±0.85）×106 cm·s-1。结论：建立的体外血脑脊液屏障模型在形态学、电阻和通透性方面具备了血脑脊液屏障的基本特性。     

氨基酸分析仪法批量测定小鼠皮质和海马中氨基酸类神经递质和牛磺酸的含量

目的：建立一种简单、准确可靠、可批量检测小鼠皮质和海马内氨基酸类神 分析方法。 方法：采用 A300 氨基酸分析仪，使用 10% 磺基水杨酸进行蛋白沉淀，锂盐试剂为流动相，茚三酮显 色，检测波长为 570 nm，对该方法的分离效果、线性范围、检出限及定量限、日内精密度和回收率、日间精密度进 行测定；选择同日龄的 SPF 级 KM 小鼠分为雌雄两组，每组断头处死 3 只，每只均于冰上分离出皮质和海马，经 匀浆、离心、蛋白沉淀、稀释、过膜等过程制成小鼠脑组织游离氨基酸样品，分别测定雌雄小鼠皮质和海马内天冬 氨酸（aspartic acid，Asp）、谷氨酸（glutamic acid，Glu）、甘氨酸（glycine，Gly）、 γ - 氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）4 种氨基酸类神经递质的含量和牛磺酸（taurine，Tau）的含量。 结果：标准样品、雌雄小鼠皮质样品 和海马样品中的 5 种目标氨基酸分离度好，在 8~400 μmol·L -1 的浓度范围内，线性良好（R ≥0.999），检测限为 1.29~1.86 μmol·L-1 ，定量限为 4.29~6.20 μmol·L-1 ，日内精密度良好（标准样品相对标准偏差 (relative standard deviation，RSD)<2.23%，脑组织样品 RSD<2.76%），脑组织样品的加标回收率为 91.52%~102.51%，采用绘制标 样峰面积曲线的方法准确获取样品中的 5 种氨基酸含量，实验用雌雄小鼠之间未发现明显统计学差异（P>0.05）。 结论：该方法简便、准确可靠，适用于小鼠皮质和海马组织中游离氨基酸含量的批量检测。     

PEG修饰姜黄素固体脂质纳米粒的制备、表征及溶出特征

目的制备具有缓释作用的姜黄素固体脂质纳米粒(curcumin solid lipid nanoparticles,Cur-SLN)和长循环固体脂质纳米粒(long-circulating solid lipid nanoparticles,LSLN),并对2种纳米粒的理化性质进行考察。方法采用乳化-超声法制备Cur-SLN,并对最优处方下制备的Cur-SLN进行包封率和载药量的测定,采用后插法制备Cur-LSLN,并考察Cur-SLN和Cur-LSLN的粒径、Zeta电位,差示扫描量热法(DSC)分析姜黄素在纳米粒中的存在状态,透射电镜观察两者的形态,透析法进行体外释放实验。结果最优处方下制备的Cur-SLN和Cur-LSLN的外观为球形及类球形,包封率分别为(89.15±0.66)%、(92.97±0.27)%,载药量分别为(1.72±0.08)%、(1.98±0.08)%,粒径分别为(144.5±4.1)、(155.0±2.6)nm,Zeta电位分别为(-23.6±0.2)、(-47.8±1.8)m V,通过DSC检测,可确定纳米粒中的Cur已转变为无定形态,体外释放实验结果显示,2种制剂的药物释放分为突释期和缓释期,均在12 h内释放较快,Cur-SLN在96 h累积释放86.63%,Cur-LSLN在96h累积释放76.98%,Cur-LSLN表现出更好的缓释效果。结论采用乳化-超声法可成功制备Cur-SLN和Cur-LSLN,PEG修饰后的纳米粒有更好的缓释性能,可延长药物在体内存在的时间,为靶向药物的开发做了铺垫。