高效液相色谱串联质谱法测定血清非结合雌三醇的前处理研究

目的优化高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定血清游离雌三醇(uE3)的前处理方法。方法以活性炭吸附血清为研究基质,通过加入已知量的雌三醇(E3)标准品及E3-2-3-4-13 C3内标,在LC-20AD XR高效液相色谱系统和API 5500串联四级杆质谱仪上对E3检测的色谱条件、质谱条件及萃取条件等进行优化。结果色谱条件:选用菲罗门Knietex色谱柱(100.0mm×2.1mm,2.6μm);有机相为甲醇,水相为0.1mmol/L氟化铵水溶液,8min梯度洗脱。质谱条件:选用电喷雾(ESI)负离子模式和多反应监测(MRM)模式分析,选择质荷比(m/z)287→m/z 145作为E3的定量离子对,m/z 287→m/z 171作为定性监测离子对;选择m/z 290→m/z 148作为内标的定量离子对,m/z 290→m/z 174作为定性监测的离子对。萃取条件:萃取剂为正己烷/乙酸乙酯(50/50,v/v),样品与萃取剂的比例为1∶2,萃取率可达85.71%。结论 E3检测的色谱条件、质谱条件、萃取条件已得到全面优化,为后续建立LC-MS/MS测定人血中uE3的参考方法打下良好基础。     

多种炎症指标联合淋巴细胞亚群在COVID-19不同临床分型的临床诊断价值分析

目的：探讨不同临床分型的新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）患者多种炎症指标水平变化规律及临床意义。方法：收集2020年1月28日至3月3日在湖北省中西结合医院住院110例COVID-19确诊患者作为研究对象,并将其按《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第7版）》诊断标准分为普通型、重型、危重型3组,回顾性分析和比较各组患者的一般资料、血清白蛋白（albumin,ALB）、C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、降钙素原（procalcitonin,PCT）及细胞因子白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）、白介素-8（interleukin-8,IL-8）、白介素-10（interleukin-10,IL-10）,以及全血CD4+ T淋巴细胞计数（CD4+ T lymphocyte,CD4+ T）、CD8+ T淋巴细胞计数（CD8+ T lymphocyte,CD8+ T）各指标水平;各组炎症指标表达的数据不符合正态分布以中位数（四分位间距）表示,普通组、重型组、危重型组肺炎组间数据差异采用Kruskal-Wallis秩和检验,组间两两比较采用Mann-Whitney U检验;对具有统计学意义的炎症指标鉴别诊断价值采用受试工作者特征曲线（receiver operator characteristic curve,ROC曲线）,并根据ROC曲线下面积（area under the curve,AUC）选取最佳诊断炎症指标。结果：对于血清IL-6、IL-10、CRP、PCT水平,危重型组＞重型组＞普通型组,ALB、CD4+ T、CD8+ T水平,普通型组＞重型组＞危重型组,差异均有统计学意义（P＜0.001）。血清IL-1β、IL-8水平在各临床分组中变化不明显,P值分别为0.388和0.128,无统计学意义（P>0.05）。IL-6与CRP/ALB 2个指标联合后AUC为0.931,敏感度为0.885,特异性为0.825。结论：血清多种炎症指标联合T淋巴细胞亚群实时检测有助于判断 COVID-19患者的临床病情评价,作为治疗效果评估、危重程度及预后等的重要参考,联合监测血清IL-6与CRP/ALB将大大提高预测COVID-19危重程度的准确率。     

同位素稀释液相色谱串联质谱法测量血清未结合雌三醇的协作研究

目的用同位素稀释液相色谱串联质谱(ID-LC/MS/MS)候选参考方法进行实验室间血清未结合雌三醇(u E3)协作研究,通过该研究进一步确认方法的性能特征(正确度和精密度),并将该方法在国内参考实验室推广,推动u E3标准化进程。方法依据ISO/WD 15725-1和GB/T 6379标准,拟定我国血清u E3协作研究方案。协作研究分为两个阶段:初步试验和正式试验,共9家参考实验室参加。按要求收集5个浓度水平样品并进行均匀性评价,分发到9家参考实验室,要求每个样品每日重复测量5次,连续测量3 d。计算各实验室测量结果的偏移和精密度,用格拉布斯(Grubbs)检验和柯克伦(Cochran)检验识别离群值和离群实验室。根据合格实验室的结果计算靶值,并向离群实验室和偏出允许范围的实验室提供整改建议。结果样品均匀性评价:所有样品测量结果计算F值均小于F0.05(9,20)临界值,样品中u E3是均匀的。初步试验:Grubbs检验,1个实验室测量结果为离群值;Cochran检验,2个实验室检验结果为离群值。剔除离群值后计算靶值;2017E301为(22.08±0.24)nmol/L;2017E302为(33.46±1.67)nmol/L。2个实验室结果超出允许范围。正式试验:Grubbs检验,所有实验室测量结果均未检出离群值;Cochran检验,3个实验室数据出现离群值。剔除离群值后计算靶值,2017E303为(10.36±0.35)nmol/L,2017E304为(15.47±0.26)nmol/L,2017E305为(46.97±1.19)nmol/L;各实验室间测量结果不精密度分别为1.14%~2.21%、0.79%~1.93%、0.60%~2.09%,测量结果偏移分别为-6.18%~4.83%、-2.26%~2.39%、-4.19%~4.07%。结论通过组织开展协作研究,确认各参考实验室通过协作研究方案能够快速建立并运行u E3候选参考方法,除个别实验室外各实验室的检测性能满足预定要求(不精密度3.0%,偏移7.5%),进一步确认了该方法的性能和各实验室运行参考方法的能力。通过初步研究和正式研究对研究方案的各实验环节进行了验证和完善;推动了u E3项目参考方法在我国参考实验室的运行,为后续厂商试剂主校准品联合定值或标准物质研制搭建了平台,促进u E3项目的标准化。     

小鼠骨髓DCs的高效扩增及其表型特征

目的:建立体外大量扩增骨髓树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells,Bm-DCs)的方法,并分析其免疫表型特征。方法:以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)从C57BL/6小鼠骨髓细胞中诱导产生骨髓未成熟树突状细胞(immol/Lature DCs,imDCs),6 d后以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)进一步刺激产生成熟树突状细胞(mature DCs,mDCs)。以流式细胞技术检测imDCs、mDCs的CD11c、MHCⅡ、CD86、B220的表达。同时检测imDCs、mDCs刺激近交系BALB/c小鼠CD4+T淋巴细胞增殖的功能。结果:(1)每只小鼠的双侧股骨可以得到(4.0～6.0)×106个DCs;(2)CD11c、MHCⅡ、CD86、B220的表达率在imDCs和mDCs分别为(71.67±1.53)%、(25.67±2.08)%、(7.67±1.53)%、(9.00±1.00)%;(81.67±1.53)%、(55.67±3.06)%、(45.33±2.08)%、(8.00±1.00)%,其中imDCs、mDCs的CD11c、MHCⅡ、CD86的表达差异具有统计学意义(P<0.01);两组DCs的B220均为低表达;(3)成熟DCs具有很强的刺激近交系小鼠T淋巴细胞增殖的能力。结论:联合应用GM-CSF、IL-4可从小鼠骨髓中诱导扩增大量DCs;诱导产生的DCs的免疫表型特征为CD11chiMHC-Ⅱ+B220-,总体与常规DCs(conventional DCs,cDCs)相似。     

血β-羟丁酸诊断2型糖尿病酮症酸中毒阈值的建立

目的 探索建立血β-羟丁酸(βOHB)诊断2型糖尿病酮症酸中毒(DKA)的阈值及βOHB水平与DKA严重程度的关系.方法 对急症科收治的2型糖尿病患者的血βOHB与[HCO3-]进行相关分析,同时利用回归方程计算出[HCO3-]为18.0、15.0、10.0 mmol/L时的βOHB值,并以与[HCO3-]为18.0 mmol/L对应的βOHB值作为DKA诊断的阈值,并结合临床评估其诊断性能.结果 血βOHB水平与[HCO3*]浓度具有良好的相关性,R2=0.7023,P＜0.001.[HCO3-]为18.0、15.0和10.0 mmol/L时的βOHB值分别为3.0、4.70和7.5 mmol/L,并与DKA病情严重程度相符;结合血糖浓度≥13.9 mmol/L,当血βOHB≥3.0 mmol/L时,诊断DKA的灵敏度为99.0％,特异性为86.0％,总有效性为92.81％.结论 血βOHB≥3.0 mmol/L可作为DKA诊断的阈值,并且βOHB可作为DKA病情严重程度的判断指标.     

28个临床化学指标3种不确定度评定方法的比较

目的探讨3种不确定度评定方法的优劣,为临床实验室选用不确定度的评定方法提供思路。方法用3种方法评定28个临床化学指标的不确定度,方法 1是澳大利亚临床生物化学家协会(AACB)建议方法;方法 2是诺德创新中心(Nordtest)建议方法;方法 3是根据室内质控数据计算不确定度。3种方法评定的扩展不确定度(U)分别与分析目标[生物学变异和美国临床实验室改进修正案(CLIA)允许总误差]比较。结果 28个指标,方法2除K和Na外,26个指标的U均比方法1高;除Na外,27个指标的U均比方法 3高。方法 1除Alb外,27个指标的U均比方法 3高。与生物学变异比较,28个指标用方法1、方法 2、方法 3评定U分别有54%、28%、62%达到理想值,12%、32%、8%达不到要求;与CLIA允许总误差比较,分别有58%、18%、74%达到理想值,2%、2%、2%达不到要求。结论临床实验室用方法 2评定测量不确定度,比方法 1和方法 3考虑到更多的不确定度来源,与生物学变异比较不合格率明显增加,提示实验室需对检测过程进行质量改进。     

血小板计数参考方法的性能评价及临床应用

目的复现血小板计数的参考方法并应用于临床。方法根据国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的流式细胞术计数血小板的参考方法,在本实验室复现该参考方法;通过2家校准实验室赋值新鲜全血,对4台不同型号血液分析仪的血小板计数结果进行正确度验证,并对结果不满意的仪器进行校准。结果血小板计数参考方法检测高、中、低值标本PLT的不精密度(CV)分别为2.2%、2.0%、8.4%,PLT在21×109/L~794×109/L范围内线性良好(r2=0.998),标本在6 h内测定结果稳定,携带污染率为0.05%,正确度偏倚小于3%。正确度验证中,Mindray BC 6800、Sysmex XE-5000i和Sysmex XT 1800i血液分析仪细胞检测结果均在可接受限内,Sysmex XS 500i血液分析仪经校准后通过验证。结论复现了ICSH推荐的血小板计数参考方法,其性能符合要求;赋值新鲜全血用于临床血液分析仪的正确度验证具有可行性,且可用于仪器的校准。     

临床标本在验证生化试剂批间结果一致性中的应用

目的探讨临床标本在验证不同批号生化试剂对临床检验结果是否具有一致性的作用。方法分别使用新旧两个批号试剂对5个不同浓度的新鲜血清标本、Roche配套质控品和Biorad质控品的13常规临床生化项目进行测定,并对结果进行统计学分析。计算各项目更换试剂批号前后之间的偏移,以美国临床医学检验部门修正法规（CLIA’88）允许总误差的1／3为标准,判断结果是否在允许范围内。结果各项目在更换试剂批号后质控结果差异无统计学意义（P〉0．05）,而临床标本中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、尿酸（UA）、总胆固醇（TC）和载脂蛋白A（APOA）等四个项目的测定结果却有统计学意义（P〈0．05）,但其偏移却在1／3CLIA’88可接受范围内,分别为2．57％、4．41％、1．81％和3．84％,可以满足临床需要。结论由于质控品基质效应的存在,质控品的结果并不能真实反应更换试剂批号后临床标本结果的一致情况,为了解决这个问题,建议最好同时使用质控品和临床标本进行更换试剂前后的比对。     

442株大肠埃希菌临床感染分布及耐药性分析

目的 分析442株大肠埃希菌临床感染分布及耐药性,为治疗大肠埃希菌感染及医院感染控制提供依据。方法 对2013年临床送检的各类标本进行细菌培养及鉴定,采用微量肉汤稀释法(MIC)法检测大肠埃希菌对临床常用抗菌药物的敏感性,采用WHONET5.5及SPSS13.0软件对数据进行统计分析。结果 442株大肠埃希菌主要分离自中段尿、分泌物,产ESBLs大肠埃希菌检出率为61.3%。442株大肠埃希菌对青霉素类、头孢菌素类、氟喹诺酮类抗菌药物耐药率较高,对β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合物敏感性较好,对碳青霉烯类抗菌药物敏感性最高。产ESBLs菌株对临床常用抗菌药物耐药率高于非产ESBLs菌株。结论 大肠埃希菌耐药性较为严峻,产ESLBs大肠埃希菌常表现出对多种不同类型抗菌药物耐药,治疗大肠埃希菌重症感染首选碳青霉烯类抗菌药物。