结核杆菌H37Rv株重组PstS1蛋白的表达纯化及其免疫反应性分析

目的:表达、纯化结核杆菌H37Rv株重组Psts1(简称rPstS1)蛋白,为结核病血清学诊断价值研究及亚单位疫苗研制提供物质基础.方法:重组质粒pET15b-Pstsl转化大肠埃希菌表达菌株BL21(DE3)plysE,IPTG诱导rPstSI蛋白表达.经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定后,优化表达...     

蜂针疗法对类风湿关节炎患者外周血TNF-α IL-1β的影响

目的：研究蜂针疗法对类风湿关节炎（RA）患者外周血肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）及抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体）等影响，以初步探讨蜂针疗法治疗RA的机理。方法：100例RA患者随机分为两组，蜂针疗法加西药治疗组50例，西药对照组50例，疗程3个月。观察患者治疗前后实验室指标变化情况。结果：两组在改善TNF-α、IL-1β、抗CCP抗体、RF、ESR、CRP、PLT、Ig等指标，与治疗前比较差异有显著性（P〈0．05或P〈0．01），蜂针治疗组治疗后上述指标改善优于西药对照组（P〈0．05或P〈0.01）。结论：蜂针疗法具有抗炎等免疫调节作用，可能通过抑制TNF-α、IL-1β等细胞因子而达到治疗RA的作用。     

结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10融合蛋白的构建和表达及其免疫反应性分析

Objective To construct esat-6-cfp-10 fusion gene (ec) and its expression vector pET-23b( + )-esat-6-cfp-10 [pET-23b( + )-ec], and express rESAT-6-CFP-10 (rEC)fusion protein of Mycobacterium tuberculosis (MTB) H37Rv and evaluate its immunoreactivity. Methods Fused gene encoding ESAT-6 and OP-10 of MTB was linked with the (Gly4Ser)3 linker by gene SOEing. Construction of TA cloning vector pMDR 19-T-esal-6-cfp-10 (pMDR 19-T-ec) was identified by PCR, restriction analysis and sequencing. After pMDR 19-T-ec was digested with double restriction enzymes (Nde Ⅰ and Xho Ⅰ ), the fused gene was inserted into prokaryotic expression vector pET-23b ( + ). The recombinant plasmid pET-23b( + )-ec was transformed into E. coli BL21(DE3) pLysE, and IPTG was used to induce the expreestion of rEC. Its expression was detected with sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot. rEC was purified by nickel-chelate affinity chromatography. The immunoreactivity of rEC was preliminarily evaluated by Western blot. Results A recombinant plasmid pET-23b( + )-ec was successfully constructed and could stably express a 21 000 rEC, which accounted for 35% total proteins of bacillus. It existed in soluble form in E. coli. After purification, the purity of rEC reached 97.2% . Its immunoreactivity was confirmed by Western blot. Conclusions The prokaryotic expression vector pET-23b( + )-ec has been constructed and the fusion protein rEC has been obtained successfully, which provides an experimental basis for the application of rEC in the diagnosis of tuberculosis.     

雷洛昔芬对慢性低氧大鼠肺动脉血管重构的作用

目的 探讨雷洛昔芬对慢性低氧大鼠肺动脉结构重构的调节作用。方法 选取体质量180~200 g的健康SD大鼠40只,♂,随机分为常氧组、低氧组、低氧+17β-雌二醇组、常氧+雷洛昔芬组、低氧+雷洛昔芬组;原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMC)分组同上。采用间断常压低氧法建立慢性低氧大鼠和细胞模型,采用免疫组织化学法检测肺动脉平滑肌的增殖情况,以蛋白免疫印迹法检测PASMC小窝蛋白(Caveolin-1,Cav-1)的表达,采用荧光探针法检测PASMC活性氧(ROS)的含量。结果 与常氧组相比,低氧组大鼠肺小动脉平滑肌增殖、中膜厚度及肌化程度明显增加(P<0.01),雷洛昔芬可显著抑制低氧诱导的肺动脉改变(P<0.05)。低氧组大鼠PASMC中ROS浓度增加(P<0.01),给予低氧组大鼠雷洛昔芬治疗,可下调ROS浓度(P<0.05)。低氧组大鼠PASMC中Cav-1表达显著降低(P<0.01),雷洛昔芬可改善其低表达(P<0.05)。雷洛昔芬的缓解肺动脉重构、上调Cav-1的表达、减少ROS的产生、抑制PASMC增殖的效果类似于17β-雌二醇。结论 雷洛昔芬可上调PASMC中Cav-1的表达,减少ROS的产生,抑制PASMC增殖,在缓解慢性低氧大鼠的肺动脉重构中发挥重要作用。     

洋葱中黄酮类化合物对结核分枝杆菌的抑菌作用研究

目的:探讨洋葱中黄酮类化合物对结核分枝杆菌的抑菌作用。方法:选用56株结核分枝杆菌临床分离株作为研究对象,结核分枝杆菌标准菌株(H_37RV)为对照用菌株,通过分格平板琼脂比例法抑菌试验,观察不同浓度洋葱中黄酮类化合物、黄酮与一线抗结核药物联合使用对结核分枝杆菌的抑菌作用;小鼠腹腔巨噬细胞与结核分枝杆菌共同孵育后,将细胞分为对照组、560μg/m L黄酮组、280μg/m L黄酮组、140μg/m L黄酮组、28μg/m L黄酮组、异烟肼(INH)组,给予相应药物干预,通过实时荧光定量PCR法检测巨噬细胞吞噬的结核分枝杆菌DNA水平,通过酶联免疫吸附法检测细胞培养液中细胞因子水平。结果:(1)与2.0μg/m L INH、1.0μg/m L利福平(REP)、5.0μg/m L乙胺丁醇(EMB)、2.0μg/m L链霉素(SM)比较,28μg/m L黄酮敏感率较低,560、280μg/m L黄酮敏感率较高,差异有统计学意义(P0.05),560、280μg/m L黄酮敏感率比较差异无统计学意义(P0.05)。(2)与2.0μg/m L INH、1.0μg/m L REP、5.0μg/m L EMB、2.0μg/m L SM比较,各药物联合使用280μg/m L黄酮后敏感率均较高,差异有统计学意义(P0.05)。(3)与INH组比较,280μg/m L黄酮组、560μg/m L黄酮组巨噬细胞吞噬的结核分枝杆菌DNA扩增Ct值较低及拷贝数较高,28μg/m L黄酮组巨噬细胞吞噬的结核分枝杆菌DNA扩增Ct值较高及拷贝数较低,差异有统计学意义(P0.05)。(4)与INH组比较,280μg/m L黄酮组、560μg/m L黄酮组细胞培养液中水平γ-干扰素、白细胞介素-1β水平较高,28μg/m L黄酮组细胞培养液中水平γ-干扰素、白细胞介素-1β、白细胞介素-6水平较低,差异有统计学意义(P0.05)。结论:洋葱中黄酮类化合物对结核分枝杆菌有明显的体外抑菌作用,能够协同INH、REP、EMB及SM抑菌,还能促进巨噬细胞释放γ-干扰素、白细胞介素-1β等细胞因子,提高巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌的能力,在≤280μg/m L范围内,黄酮类化合物浓度越高作用越强。     

189株嗜麦芽寡养单胞菌耐药性检测与氨基糖苷类修饰基因的分布

目的调查嗜麦芽寡养单胞菌对常用抗菌药物的耐药率及氨基糖苷类修饰基因的分布状况。方法采用琼脂扩散试验法,对临床分离的189株嗜麦芽寡养单胞菌的耐药性进行了检测;以PCR法检测189株嗜麦芽寡养单胞菌氨基糖苷类修饰酶基因。结果临床分离的189株嗜麦芽寡养单胞菌对亚胺培南和阿米卡星的耐药率分别为19.05%和23.81%;其中,aac(3)-Ⅰ检测到23株、aac(3)-Ⅱ检测到45株、aac(6)-Ⅰb检测到13株、aac(6)-Ⅱ检测到9株,分别占12.17%、23.81%、6.88%、4.76%。结论嗜麦芽寡养单胞菌对临床常用抗菌药物耐药性已非常严重,存在大量耐药基因。     

问号钩端螺旋体T和B细胞表位联合基因的原核表达及其产物免疫性分析

目的 构建问号钩端螺旋体(简称钩体)LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T-和B-细胞联合表位融合基因及其原核表达系统,并对表达产物的免疫原性进行鉴定.方法 人工合成多表位联合基因并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE检测重组蛋白;采用MAT检测重组蛋白兔抗血清与我国钩体标准参考株的凝集效价;Western blot和ELISA检测重组蛋白的免疫原性.结果 获得了多表位融合基因并构建了原核表达系统.表达产物的相对分子质量约为23×103,且主要以可溶性形式存在;重组蛋白兔抗血清免疫双扩散效价为1∶8,该抗血清能与我国15群的钩体标准参考株发生凝集反应,ELISA证明该重组蛋白能检测不同群型钩体感染患者血清中的抗钩体抗体.结论 成功构建了包含钩体LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T和B细胞联合表位基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及血清学检测的抗原.     

katG基因二个不同区域基因变异与结核分枝杆菌异烟肼耐药的相关性研究

目的 分析结核分枝杆菌katG基因2个不同区域的基因变异,并确定与INH耐药的相关性.方法 从痰液分离并鉴定结核分枝杆菌耐INH菌株53株,用PCR扩增katG基因的2个区域:区域1为第1位密码子至150位密码子,区域2为第227位密码子至470位密码子,并分别测序.结果 3株对INH耐药但2个区域都不发生突变.14株区域1存在突变,其中5株只在区域1存在突变,5株在区域1出现缺失突变,并呈现高度耐药.点突变是区域2的主要特点,特别是S315位密码子,60.4%(32/53)S315发生突变,最常见的是S315N(AGC→AAC)(18株);katG S315在高度INH耐药和低度INH耐药的结核分枝杆菌中突变率分别是84.4%(27/32)、15.6%(5/32),两组间差异有统计学意义(x2=30.25,P＜0.01).27株S315突变呈高度耐药,占S315突变菌株总数的84.4%,其余18株至少有一个非S315点突变的耐药株中高度耐药只有5株,占27.7%,两组间差异有统计学意义(x2=16.02,P＜0.01).对INH耐药的结核分枝杆菌区域2的突变发生率为84.9%.5株只在区域1存在突变,通过检测基因突变诊断INH耐药的检出率上升至94.3%.结论 S315突变发生率最高,突变类型和位置与耐药程度密切相关,分析区域1能使检出率提高9.4%.

Abstract：

Objective To analyze and compare the mutations in two different regions of the katG gene and study the relevance of Mycobacterium tuberculosis isoniazid-resistance and mutations in two different regions of the katG gene. Methods Fifty-three INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in cultures of sputum samples obtained from Zhejiang province were analyzed. PCR was used to amplify two regions of the katG gene (GenBank accession no. U06258) region 1 (from codon 1 to codon 150) and region 2 ( from codon 227 to codon 470) which were then sequenced in order to identify mutations. Results Three strains resistant to INH did not contain mutations in either region. Fourteen strains carried mutations in region 1. Among them 5 strains barbered deletions, and showed high-level resistance to isoniazid. Five strains had mutations only in region 1. Region 2 carried multiple point mutations, especially at codon 315, and there were S315 N ( AGC→AAC ) substitution in 18 of those cases. The frequency of mutations in the katG S315 of high-level INH-resistance isolates ( 84. 4%, 27/32) was significantly higher than those of low-level INH-resistance isolates( 15.6%, 5/32 ), there was statistically significant difference (x2 = 30. 25, P ＜ 0. 01 ).katG S315 mutations in high-level INH-resistance frequency (84. 4%, 27/32) was significantly higher than the other mutations of katG gene of high-level INH-resistance frequency (27. 7%, 5/18 ), there was significant difference (x2 = 16.02, P ＜ 0. 01 ). The analysis of region 2 allowed INH resistance to be diagnosed in 84. 9% of the strains. Five strains had mutations only in region 1 ,which allowed the proportion of INH-resistant strains identified to be increased to 94. 3%. Conclusions The number of mutations at codon 315 was high. Mutation type and location closely related with drug resistance and the analysis of region 1 resulted in a 9. 4% increase in the rate at which mutations were identified.     

耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因序列研究

目的研究杭州地区结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)对利福平(RFP)的耐受与rpoB基因突变的关系.方法随机挑选了90例结核杆菌感染的病例,选择了利福平作为主要的药物进行药敏实验,PCR扩增39株耐RFP结核分支杆菌的rpoB基因片段(580bp);测定扩增片段的序列,并与美国国立生物信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)检索获得结核杆菌野生株(利福平敏感株)序列(登陆号:AJ749948)作对比分析.结果结果显示PCR结核测序方法得到了39例结核杆菌耐药株,51例敏感株,与药敏实验的方法检测的结果完全一致.测定的11株临床分离的耐药株中,526位或531位有突变,其中526位有突变的有7株,占耐药测定株63.6%,531位突变的有4株,占耐药测定株36.4%,未见两位点同时突变.检测的11株敏感株,未见526位或531位有突变.结论杭州地区结核分支杆菌耐利福平的发生与rpoB基因的526位或531位突变密切相关,与国外的报告基本相似.但526位突变占耐药测定株高达63.6%,如此高比例目前国内外未见相似报道.PCR扩增和产物测序将是临床检测结核分支杆菌耐利福平和耐多药的一种迅速、准确的方法.     

耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因序列研究

目的 研究杭州地区结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）对利福平（RFP）的耐受与rpoB基因突变的关系。方法 随机挑选了90例结核杆菌感染的病例。选择了利福平作为主要的药物进行药敏实验，PCR扩增39株耐RFP结核分支杆菌的rpoB基因片段（580bp）；测定扩增片段的序列。并与美国国立生物信息中心（www．ncbi．nlm．nih．gov／nucleotide）检索获得结核杆菌野生株（利福平敏感株）序列（登陆号：AJ749948）作对比分析。结果 结果显示PCR结核测序方法得到了39例结核杆菌耐药株。51例敏感株，与药敏实验的方法检测的结果完全一致。测定的11株临床分离的耐药株中，526位或531位有突变，其中526位有突变的有7株，占耐药测定株63．6%，531位突变的有4株。占耐药测定株36．4％。未见两位点同时突变。检测的11株敏感株，未见526位或531位有突变。结论 杭州地区结核分支杆菌耐利福平的发生与rpoB基因的526位或531位突变密切相关，与国外的报告基本相似。但526位突变占耐药测定株高达63．6％。如此高比例目前国内外未见相似报道。PCR扩增和产物测序将是临床检测结核分支杆菌耐利福平和耐多药的一种迅速、准确的方法。