高效液相色谱法同时测定枳实中6种成分的含量

目的:建立高效液相色谱(HPLC)法同时测定枳实药材中柚皮素、橙皮素、马尔敏、6',7'-二羟基香柠檬素、川陈皮素和桔皮素6种成分含量的方法。方法:采用Symmetry C₁₈(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱,以乙腈-水为流动相,梯度洗脱,流速1.0 ml·min^-1,检测波长324 nm,柱温30 ℃。结果:柚皮素、橙皮素、马尔敏、6',7'-二羟基香柠檬素、川陈皮素和桔皮素分别在0.105~10.518,0.0865~8.647,0.106~10.620,0.106~10.575,0.131~13.103,0.137~13.743 μg·ml^-1范围内呈良好的线性关系(r≥0.999 7);平均加样回收率分别为96.53%,101.15%,98.94%,97.87%,99.43%,102.87%,RSD均小于3.0%(n=6)。结论:该法简便、快速、重现性好,为枳实药材及饮片的质量控制提供参考。     

基于指纹图谱和UPLC-MS/MS定量测定对不同产地陈皮的质量评价研究

目的 采用HPLC指纹图谱与化学计量学相结合、UPLC-MS/MS测定多黄酮成分含量的方法,测定不同产地陈皮质量,为其鉴别和质量控制提供依据。方法 采用HPLC-DAD指纹图谱检测并结合“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版）”建立6个产区,49个不同批次陈皮药材（S1～S49）指纹图谱,并进行相似度评价和共有峰确认,结合聚类分析（hierarchical clustering analysis,HCA）、主成分分析（principal component analysis,PCA）、正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis,OPLS-DA）等化学计量学综合分析。采用UPLC-MS/MS法建立了8个黄酮类成分柚皮素、柚皮苷、木犀草苷、川陈皮素、橙皮素、橙皮苷、橘皮素和芸香柚皮苷的含量测定方法对60批7个产地陈皮药材进行评价。结果 建立了49批不同产地陈皮药材的指纹图谱,相似度为0.864～0.999,共标定了11个共有峰,HCA分析49批陈皮明显分为4类;PCA得到5个主成分的累积方差贡献率为92.748%;OPLS-DA表明8、7、10和11号峰可能是影响陈皮药材质量的差异标志物;含量测定结果表明不同产地陈皮中黄酮类含量存在显著差异,广东新会以川陈皮素和橘皮素为主要标志成分,四川荷花池以木犀草苷为差异性成分,江西樟树以柚皮素和柚皮苷为差异性成分,广西玉林则以橙皮素、橙皮苷和芸香柚皮苷为主,重庆云阳以川陈皮素和橙皮苷为主。结论 建立了稳定性强的不同产地陈皮HPLC指纹图谱和8个黄酮类UPLC-MS/MS定量测定方法,结合化学计量学可用于陈皮药材综合评价和质量控制。     

Tangeretin and its metabolite 4'-hydroxytetramethoxyflavone attenuate EGF-stimulated cell cycle progression in hepatocytes; role of inhibition at the level of mTOR/p70S6K

BACKGROUND AND PURPOSE

The mechanisms by which the dietary compound tangeretin has anticancer effects may include acting as a prodrug, forming an antiproliferative product in cancer cells. Here we show that tangeretin also inhibits cell cycle progression in hepatocytes and investigate the role of its primary metabolite 4′-hydroxy-5,6,7,8-tetramethoxyflavone (4′-OH-TMF) in this effect.

EXPERIMENTAL APPROACH

We used epidermal growth factor (EGF)-stimulated rat hepatocytes, with [³H]-thymidine incorporation into DNA as an index of progression to S-phase of the cell cycle, and Western blots for phospho-proteins involved in the cell signalling cascade.

KEY RESULTS

Incubation of tangeretin with microsomes expressing CYP1A, or with hepatocytes, generated a primary product we identified as 4′-OH-TMF. Low micromolar concentrations of tangeretin or 4′-OH-TMF gave a concentration-dependent inhibition of EGF-stimulated progression to S-phase while having little effect on cell viability. To determine whether time for conversion of tangeretin to an active metabolite would enhance the inhibitory effect we used long pre-incubations; this reduced the inhibitory effect, in parallel with a reduction in the concentration of tangeretin. The EGF-stimulation of hepatocyte cell cycle progression requires signalling through Akt/mTOR/p70S6K kinase cascades. The tangeretin metabolite 4′-OH-TMF selectively inhibited S6K phosphorylation in the absence of significant inhibition of upstream Akt activity, suggesting an effect at the level of mTOR.

CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS

Tangeretin and 4′-OH-TMF both inhibit cell cycle progression in primary hepatocytes. The inhibition of p70S6K phosphorylation by 4′-OH-TMF raises the possibility that inhibition of the mTOR pathway may contribute to the anticancer influence of a flavonoid-rich diet.     

基于HPLC指纹图谱研究衢枳壳与不同栽培变种枳壳质量差异

目的 基于HPLC指纹图谱技术和统计学分析方法,比较和评价常山柚橙Citrus aurantium ‘Changshan-huyou’未成熟的干燥果实（衢枳壳）与不同栽培变种酸橙间质量的一致性与差异性。方法 使用Extend XDB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）,检测波长330 nm,以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,体积流量1.0 mL/min,柱温为30℃。通过聚类分析（cluster analysis,CA）和主成分分析（principal component analysis,PCA）对35批样品的指纹图谱进行评价。结果 建立的酸橙枳壳的指纹图谱共有模式获得24个共有峰,并指认出12个目标化合物。13批衢枳壳样品的相似度结果范围0.920～0.947,质量一致性好,不同基原枳壳相似度结果为0.127～0.990,质量差异大。CA将衢枳壳均与酸橙枳壳聚为一类,朱栾和部分黄皮酸橙单独聚为一类,结合PCA获得区分不同基原枳壳的差异性标志物,其中9个已知化合物分别为葡萄内酯水合物、川陈皮素、柚皮苷、桔皮素、木犀草素、新橙皮苷、芸香柚皮苷、橙皮苷、柚皮...     

橘皮素通过抑制Notch信号通路干预小鼠肝纤维化进程

目的 探讨橘皮素对胆汁淤积性肝纤维化小鼠模型的治疗机制。方法 将45只C57BL/6J小鼠随机分为假手术组（n=10）、胆总管结扎手术（biliary duct ligation, BDL）模型组（n=15）、橘皮素治疗组（n=10）及单纯橘皮素用药组（n=10）。药物治疗组中,BDL手术10d后开始橘皮素灌胃,模型建立30d后采血处死各组小鼠并留取肝组织。通过H-E染色、Masson及天狼星红染色分析各组小鼠肝组织纤维化程度;采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测各组小鼠血清肝功能指标丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)及纤维化指标透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)水平;通过蛋白质印迹、荧光定量聚合酶链反应(PCR)、免疫组织化学方法检测各组小鼠肝组织中羟脯氨酸(Hyp)含量及Notch通路各组分表达量变化;通过免疫组化法检测肝纤维经典通路TGF-β1/smads通路各组分表达量变化。结果 造模30d后,与BDL模型组相比,橘皮素治疗组小鼠肝纤维化假小叶减少,纤维化病理评分值低（P<0.05）;胶原纤维沉积减少（P<0.05）,Ⅰ型胶原纤维总量减少（P<0.05）;小鼠肝功能指标ALT、AST明显降低（P<0.05）,纤维化指标HA、LN降低（P<0.05）;Hyp含量降低（P<0.05）,Notch信号通路组分Notch1、RBPJ、Hes1、Hey1蛋白及RNA表达量均下调（均P<0.05）;肝纤维化TGF-β1/smads经典通路组分TGF-β1、smad2及smad3表达量下调（均P<0.05）。结论 橘皮素作为Notch信号通路抑制剂可通过与TGF-β1/smads通路相互作用延缓肝纤维化进程。     

RP-HPLC法同时测定橘叶中3个黄酮类成分的含量

目的:建立同时测定橘叶中川陈皮素、橘红素、5-去甲川陈皮素含量的反相高效液相色谱法。方法:采用Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相为甲醇-乙腈-水(体积比30∶30∶40),流速1.0 mL.min-1,检测波长342 nm;柱温为室温(25℃)。结果:川陈皮素、橘红素、5-去甲川陈皮素线性范围分别为0.239～2.870μg(r=0.9995),0.102～1.224μg(r=0.9995),0.054～0.643μg(r=0.9995);平均回收率(n=6)分别为98.06%,98.02%,97.61%,RSD分别为2.6%,1.9%,2.0%。结论:本法快速、简便、准确,重复性好,可用于橘叶川陈皮素、橘红素、5-去甲川陈皮素的定量分析和质量控制。     

“一测多评”法测定陈皮中3种黄酮类成分

目的:建立陈皮中橙皮苷、川陈皮素、桔皮素"一测多评"的方法,并验证该方法的准确度及可行性。方法:以橙皮苷为指标,计算川陈皮素、桔皮素与橙皮苷的相对校正因子。采用外标法测定陈皮中橙皮苷、川陈皮素、桔皮素的含量,并利用相对校正因子计算川陈皮素和桔皮素的含量,比较外标法与"一测多评"的结果,以验证"一测多评"法的准确度及可行性。结果:"一测多评"法与外标法共测定22批样品,川陈皮素与桔皮素测定结果 RSD均<2.9%,结果无显著差异。结论:"一测多评"法测定陈皮中的橙皮苷、川陈皮素、桔皮素是准确可行的。     

陈皮、青皮中4种黄酮成分的比较研究

目的比较浙江、湖北、广东产陈皮、青皮药材中橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素和橘皮素的量。方法用甲醇超声提取药材,HPLC法测定,采用Waters xbridge C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm);流动相为乙腈-0.5%醋酸水,梯度洗脱(0~20 min,10%~25%乙腈;20~35 min,25%~70%乙腈;35~38 min,70%~95%乙腈);体积流量1m L/min;柱温30℃;检测波长283 nm。结果陈皮、青皮药材中4种黄酮类成分均以橙皮苷含有量为最高,柚皮苷含有量最低;浙江和湖北产陈皮和青皮中橙皮苷的含有量均符合《中国药典》标准,但两地的青皮中川陈皮素和橘皮素的量要远大于陈皮。广东新会产陈皮和青皮中橙皮苷的含有量均偏低,但它们的川陈皮素和橘皮素的含有量相差不大。结论陈皮和青皮中黄酮类成分含有量的差异可用于解释它们功效之间的区别。     

橘红素自微乳给药系统的制备及体内吸收研究

目的：设计和优化橘红素自微乳给药系统,改善药物的溶解及吸收,提高橘红素的口服生物利用度。方法：通过考察自微乳的粒径与粒径分布、乳化速度、Zeta电位、外观等指标,筛选并优化橘红素自微乳给药系统的处方,利用MDCK模型测定自微乳给药系统的体外吸收转运行为,并评价该给药系统在大鼠体内的药动学特性。结果：MDCK实验证实橘红素自微乳给药系统能够提高橘红素的吸收和转运,在SD大鼠体内的药动学结果表明橘红素的AUC_（0-∞）由（3 491.77±404.06）μg·L^-1·h提高至（9 435.18±1 633.81）μg·L^-1·h（P<0.01）,C_max由（1 211.39±382.73）μg·L^-1·h提高至（2 371.73±481.87）μg·L^-1·h（P<0.05）。结论：制备出稳定的橘红素自乳化给药系统,体外溶出速度显著提高,从而有效提高橘红素的生物利用度。     

参一胶囊联合FOLFOX4方案治疗索拉非尼耐药的晚期原发性肝癌的临床研究

目的 建立高效液相结合一测多评（HPLC-QAMS）法同时测定金果含片中哈巴苷、哈巴俄苷、柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、橘红素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的方法。方法 采用Agilent HC C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）,流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液,梯度洗脱;检测波长为210 nm（哈巴苷和哈巴俄苷）和296 nm（柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、橘红素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B）;体积流量1.0 mL/min;进样量10 μL;柱温30℃。进行专属性试验、线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收率试验。以橙皮苷为内参物,建立该成分与哈巴苷、哈巴俄苷、柚皮芸香苷、川陈皮素、橘红素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的相对校正因子（RCF）,并计算金果含片中8种成分的含量,同时与外标法的测定结果进行比较,验证该方法的可行性。结果 哈巴苷、哈巴俄苷、柚皮芸香苷、橙皮苷、川陈皮素、橘红素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B检测质量浓度的线性范围分别为6.54～163.50、2.27～56.75、8.16～204.00、17.95～448.75、1.88～47.00、0.54～13.50、1.48～37.00和0.76～19.00 μg/mL（r值范围0.999 1～0.999 8）;平均加样回收率及RSD值分别为99.85%（0.76%）、97.62%（1.07%）、100.09%（0.64%）、99.80%（0.71%）、97.48%（1.44%）、98.25%（1.60%）、96.90%（1.03%）、96.87%（1.31%）,方法学验证结果均符合要求。HPLC-QAMS法计算值与外标法实测值无显著性差异。结论 所建立的HPLC-QAMS法简便、有效、准确,可用于金果含片中多指标成分含量的同时测定,为提升金果含片的质量控制方法提供参考依据。