基于HPLC指纹图谱、多指标成分含量测定结合化学计量学的怀牛膝质量评价＊

目的 本实验采用HPLC方法建立来自3个产地15批怀牛膝药材的指纹图谱，并对β-蜕皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮进行含量测定，同时通过化学计量学的方法对15批怀牛膝进行质量评价。方法 选用Waters SunFire C₁₈（150 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，检测波长280 nm，以乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱，流速为1.0 mL·min^-1，柱温25℃，进样量10 μL。以β-蜕皮甾酮峰为参照峰，运用软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》对15批怀牛膝药材进行相似度分析，使用Metabo Analyst 5.0网站进行聚类热图分析，使用SIMCA 14.1软件进行PCA和PLS-DA分析。结果 标定了31个共有指纹峰，指认了3个已知成分，并对其进行含量测定，化学计量学分析结果将15批怀牛膝药材样品分为3类，并且筛选了不同产地间潜在的差异性成分。结论 该方法具有良好的精密度、重复性以及稳定性，可为怀牛膝的质量评价与控制提供科学依据及参考。     

藏药细叶亚菊的质量标准研究＊

目的 建立细叶亚菊的质量标准，为其质量控制和合理开发利用提供科学参考。方法 采用性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱法（TLC）对细叶亚菊进行定性分析；参照《中国药典》（2020年版）通则方法对细叶亚菊水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物进行含量检查；利用高效液相色谱法（HPLC）测定细叶亚菊中绿原酸、异绿原酸A的含量。结果 确定了细叶亚菊的药材性状及显微特征。TLC鉴别显示，供试品（细叶亚菊药材）与对照品（绿原酸、异绿原酸A）在相应位置上均显示相同颜色的荧光斑点。13批细叶亚菊水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物的含量分别为8.55%-13.07%、6.81%-12.68%、1.11%-3.53%、8.41%-11.64%；绿原酸、异绿原酸A的含量范围分别为0.072%-0.440%、0.283%-1.324%（n=3）。结论 本研究建立的方法准确稳定，可为细叶亚菊的质量控制提供参考。暂规定细叶亚菊水分不得过12.0%，总灰分不得过10.0%，酸不溶性灰分不得过2.5%，水溶性浸出物不得少于8.0%，绿原酸不得少于0.2%，异绿原酸A不得少于0.6%。     

慢性高原病脑部多体素1H-MRS研究

目的利用多体素氢质子磁共振波谱成像(hydrogen proton magnetic resonance spectroscopy,¹H-MRS)探讨慢性高原病(chronic mountain sickness,CMS)长期缺氧状态下脑部代谢物的特点,并比较各代谢物与血液指标之间的相关性。材料与方法前瞻性纳入青海大学附属医院经临床确诊为CMS的17例男性患者作为实验组,年龄(53.29±9.03)岁,居住海拔(3989.12±937.45)m,血红蛋白(hemoglobin,HGB)(224.35±11.81)g/mL,并招募与实验组年龄及居住海拔相匹配的18名健康男性志愿者作为对照组,年龄(48.61±8.76)岁,居住海拔(3674.94±634.27)m,HGB(156.67±9.46)g/mL。采用Siemens Prisma 3.0 T MR扫描仪20通道头颅线圈对所有受试者行常规头颅MRI及多体素;H-MRS检查,通过Syngo.via后处理软件获得;H-MRS图,ROI选取双侧额叶及海马区,并获得相应脑区N-乙酰天门冬氨酸/肌酸(NAA/Cr)、胆碱/肌酸CHo/Cr、乙酰天门冬氨酸/胆碱(NAA/CHo)、乳酸/肌酸(Lac/Cr)的比值。结合独立样本t检验及非参数曼-惠特尼U检验以比较两组间代谢物相对浓度差异,然后将CMS组双侧额叶及海马区各代谢物比值与血液生化指标作相关性分析。结果(1)两组受试者年龄、长期居住海拔差异均无统计学意义(P>0.05),而与对照组相比,CMS组HGB、红细胞计数(red blood cell count,RBC)、血细胞比容(hematocrit,HCT)增高,血小板(blood platelet,简称PLT)减低,差异均有统计学意义(P<0.01);(2)与对照组相比,CMS组双侧额叶及海马区NAA/Cr及NAA/CHo均减低(P<0.05),Lac/Cr增高(P<0.05),差异均具有统计学意义;(3)与对照组相比,CMS组双侧额叶及双侧海马区CHo/Cr均增高(P>0.05),差异无统计学意义;(4)CMS组右侧额叶及左侧海马CHo/Cr与RBC明显正相关,左侧额叶CHo/Cr与HCT低度正相关,右侧额叶及左侧海马Lac/Cr与HCT低度正相关。结论CMS长期缺氧状态下脑组织局部代谢物改变,神经元受损,无氧代谢增加,且这些代谢物的改变与血液指标呈一定的相关性,可为临床后续进一步预防或干预CMS患者脑损害提供影像学证据及监测指标。     

基于人工智能的骨龄辅助评价系统对四川地区完全性生长激素缺乏症患儿骨龄研究

目的探讨采用基于"人工智能(AI)的骨龄辅助评价系统(上海初云医疗科技有限公司与四川大学华西第二医院合作开发)"(以下简称为AI系统)对完全性生长激素缺乏症(CGHD)患儿诊断及骨龄评价准确性。 方法选择2014年7月至2019年11月，于四川大学华西第二医院确诊的66例来自四川地区CGHD患儿为研究对象，纳入研究组。选择同期于病例收集医院儿童保健科进行骨龄测定的67例来自四川地区身高达标儿童作为对照，纳入对照组。对每例受试儿进行左手腕关节正位X射线摄片骨龄测定，由2位医师采用《TW₂骨龄评分法中国未成年人南方标准》(以下简称为TW₂CHN)》与《TW₃骨龄评分法标准》(以下简称为TW₃)，盲法评价受试儿TW₂CHN-桡、尺、掌指骨(RUS)与TW₂CHN-腕骨(carpal)、TW₂CHN-20、TW₃-RUS及TW₃-carpal骨龄(以下简称为5种传统骨龄)，以及以同性别、年龄身高达标儿童5种传统骨龄为标准，计算受试儿5种传统骨龄百分位数。同时，采用AI系统分别对每例受试儿采取TW₂CHN与TW₃法，评价其AI-TW₂CHN-RUS、AI-TW₂CHN-carpal、AI-TW₂CHN-20、AI-TW₃-RUS及AI-TW₃-carpal骨龄(以下简称为5种AI骨龄)及其相应百分位数。以上述5种传统骨龄＋5种AI骨龄(以下简称为10种骨龄)相应的P₅₀、P₂₅、P₁₀、P₃值(统称为P_n值)作为诊断CGHD患儿临界值，分别计算其诊断CGHD患儿的敏感度、特异度、约登(Youden)指数、准确率、阳性似然比、阴性似然比、阳性预测值、阴性预测值。采用Kappa值评价2组受试儿5种传统骨龄百分位数与对应的5种AI骨龄百分位数评价结果的一致性，以及2位医师对2组受试儿TW₂CHN-RUS骨龄百分位数评价结果一致性。绘制上述10种骨龄百分位数诊断CGHD患儿的受试者工作特征(ROC)曲线，并计算曲线下面积(AUC)。采用配对t检验，对2组受试儿TW₂CHN骨龄与TW₃骨龄进行比较。本研究遵循的程序符合2013年新修订的《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求。2组受试儿年龄、性别构成比等一般临床资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。 结果①采用10种骨龄的P_n值分别作为诊断CGHD临界值，对133例受试儿CGHD诊断结果显示，除了TW₃-RUS骨龄中，以骨龄≤P₁₀作为诊断CGHD患儿临界值时的诊断准确率最高(85.0%)，TW₂CHN-RUS、TW₂CHN-carpal、TW₂CHN-20、TW₃-carpal、AI-TW₂CHN-RUS、AI-TW₂CHN-carpal、AI-TW₂CHN-20、AI-TW₃-carpal、AI-TW₃-RUS骨龄中，均为以骨龄≤P₂₅作为临界值时，对CGHD的诊断准确率最高，分别为81.9%、75.2%、88.0%、78.2%、75.2%、73.6%、81.2%、72.9%、78.9%。②一致性检验结果显示，2组受试儿TW₂CHN-RUS与AI-TW₂CHN-RUS、TW₂CHN-carpal与AI-TW₂CHN-carpal、TW₂CHN-20与AI-TW₂CHN-20、TW₃-RUS与AI-TW₃-RUS、TW₃-carpal与AI-TW₃-carpal骨龄百分位数评价结果均为中等一致性，Kappa值分别为0.445、0.578、0.570、0.446、0.430(均为P<0.001)。③对2位医师对2组受试儿TW₂CHN-RUS骨龄百分位数评价结果进行一致性检验显示，其Kappa值为0.790(P<0.001)，一致性较高。④绘制10种骨龄百分位数评价结果诊断CGHD的ROC曲线分析结果显示，TW₂CHN-RUS、TW₂CHN-carpal、TW₂CHN-20、TW₃-carpal、TW₃-RUS、AI-TW₂CHN-RUS、AI-TW₂CHN-carpal、AI-TW₂CHN-20、AI-TW₃-carpal、AI-TW₃-RUS骨龄百分位数诊断CGHD患儿的AUC分别为0.932、0.859、0.915、0.895、0.844、0.823、0.805、0.866、0.860、0.764(均为P<0.001)。⑤133例受试儿的TW₃-RUS、TW₃-carpal、AI-TW₃-RUS、AI-TW₃-carpal骨龄，均分别显著低于TW₂CHN-RUS、TW₂CHN-carpal、AI-TW₂CHN-RUS、AI-TW₂CHN-carpal骨龄，并且差异均有统计学意义(t＝21.746、25.287、16.498、9.290，P<0.001)。 结论TW₂CHN法、TW₃法对CGHD患儿骨龄评价及诊断均有临床价值，TW₂CHN-RUS骨龄对于CGDH患儿诊断效能高。四川地区儿童TW₃骨龄较TW₂CHN骨龄低，TW₃法可能不完全适用于四川地区儿童骨龄评价。AI系统对于四川地区CGHD患儿骨龄评价结果与传统骨龄评价结果具有中等一致性，可为临床医师评价受试儿骨龄提供帮助。     

高效液相色谱-串联质谱法测定雷公藤制剂中5种有效成分的含量

目的:建立高效液相色谱-串联质谱法测定雷公藤制剂中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤晋碱、雷公藤次碱和雷公藤红素的含量。方法:采用电喷雾正电离模式和多反应监测模式。雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤晋碱和雷公藤次碱含量测定,以含5 mmol·L^-1碳酸氢铵的水溶液和纯甲醇作为流动相,采用梯度洗脱方式在ACE UltraCore SuperPhenylHexyl(2.1 mm×50.0 mm,5 μm)色谱柱上进行分离。雷公藤红素含量测定,以含0.5%甲酸的水溶液和含0.1%甲酸的乙腈作为流动相,采用等度洗脱在ACE Excel C₁₈-AR(2.1 mm×50.0 mm,5 μm)色谱柱上进行分离。结果:雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤晋碱、雷公藤次碱和雷公藤红素分别在2.4~1 200,2.0~1 000,80~40 000,80~40 000和10~5 000 ng·mL^-1范围内线性关系良好,平均加样回收率分别为 94.56%,102.36%,93.27%,95.67%和99.82%,RSD均低于5.13%。结论:本方法运行时间短,灵敏度高,精密度和重复性好,适用于雷公藤制剂中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤晋碱、雷公藤次碱和雷公藤红素5种活性成分定量检测,可为雷公藤制剂多指标质量控制提供实验依据。     

HPLC同时测定归芍疏肝散中芍药苷阿魏酸和甘草酸铵的含量

目的:建立同时测定归芍疏肝散中芍药苷、阿魏酸和甘草酸铵含量的高效液相色谱法。方法:采用Amethyst C18色谱柱(200 mm×4.6 mm,5μm),乙腈-0.1%磷酸为流动相,梯度洗脱,流速为1.0 mL·min-1,检测波长为237 nm,柱温为30℃。结果:在线性范围内3种成分线性良好(r≥0.9998),精密度RSD均<2%;重复性RSD均<3%;平均回收率98.81%~100.25%,RSD均<2%。结论:该方法快捷,操作简便,结果可靠,可用于归芍疏肝散的质量控制。     

灰毡毛忍冬LmC3H1基因的克隆及表达模式与绿原酸含量相关性分析

目的:以灰毡毛忍冬为材料,克隆对-香豆酸3-羟化酶(LmC3H1)基因,进行生物信息学和表达模式分析,结合绿原酸含量,研究推测灰毡毛忍冬LmC3H1基因的功能。方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和RACE技术克隆LmC3H1基因的全长c DNA序列,对该序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和HPLC分别测定灰毡毛忍冬茎、叶及不同花期花中LmC3H1的相对表达量及绿原酸含量。结果:克隆得LmC3H1(Gen Bank:MN177695)基因,开放阅读框(ORF)长度为1 533 bp,编码510个氨基酸,推测其分子式为C_(2618)H_(4134)N_(718)O_(727)S_(22),相对分子质量为58 005.32,等电点8.92,为亲水性蛋白,定位于叶绿体中,具有跨膜区域LLLIPAVLFLISLVYPLI,含有细胞色素P450的保守结构域CYTOCHROME_P450(422-433 aa);Real-time PCR结果显示,LmC3H1在灰毡毛忍冬茎、叶及不同花期花有不同程度的表达,其中在花发育阶段,白色花蕾期相对表达量最高,花蕾初期及白色开花期次之;白色花蕾期花与茎、叶比,花的相对表达量最高,叶的最低;HPLC结果显示,从绿白色花蕾期到金黄色开花期绿原酸含量呈上升趋势,金黄色开花期含量最高,不同器官中,花中绿原酸最高,茎最低。结论:克隆得到灰毡毛忍冬LmC3H1基因,推测LmC3H1可能参与灰毡毛忍冬花绿原酸的生物合成。该研究为进一步研究该基因的功能及探究灰毡毛忍冬绿原酸生物合成和调节机制提供了依据,同时为遗传改良灰毡毛忍冬品质奠定了基础。     

Highly sensitive sex determination method using the exon 1 region of the amelogenin gene

Sex determination is a crucial factor in the identification of unidentified human remains. Sex determination by DNA analysis is particularly useful because it can be applied to samples for which morphological characteristics are unavailable. Because samples handled in forensic DNA typing are easily degraded by environmental factors and microorganisms, there is a need for a method that can accurately determine sex even in highly decayed samples. Previous studies mainly used sex differences in an intron of the amelogenin gene. However, this region is highly polymorphic, and there are cases where accurate sexing cannot be performed because of genetic mutations in the target region. Thus, for reliable sex determination, it is desirable to select loci with as few non-sexual polymorphisms as possible. In this study, we focused on the exon 1 region of the amelogenin gene, which has very little polymorphism other than sex differences. We developed a primer set for sex determination and compared it with the GlobalFiler™ PCR Amplification Kit (GF), which is widely used for forensic DNA typing. The results showed that the amount of DNA required for accurate sex determination was 25 pg for both methods, achieving equivalent sensitivity. Next, we compared the two methods using ancient human skeletons and found that the present method with its shorter amplicon was considerably superior to GF. The present method is simple, rapid, inexpensive, and suitable for analyzing highly degraded samples. Therefore, this method is expected to contribute to forensic sciences and physical anthropology.     

A fully automated sex estimation for proximal femur X-ray images through deep learning detection and classification

PurposeTo develop a fully automated deep learning pipeline using digital radiographs to detect the proximal femur region for accurate automated sex estimation.MethodRadiograph predictive features from 2122 Chinese Han clinical pelvic with ages ranging from 18 to 26 years were collected retrospectively to train and test the sex prediction model using deep machine learning’s convolutional neural networks (CNN). Model performance was assessed using a Chinese Han population with 361 samples and a white population with 50 samples. The average accuracy of the sex estimation of the two test datasets was determined.ResultsFor the Chinese Han population test dataset, the sex estimation accuracy was 94.6% (males: 93.9% and females: 94.7%). For the white population samples, the accuracy of sex estimation was 82.9% (males: 80.9% and females: 88.6%). The accuracy of CNN tested in the Chinese population was significantly higher than that tested in the White population (p < 0.001)ConclusionsThe model based on convolutional neural networks has an accuracy similar to that of current state-of-the-art mathematical functions using manually extracted features for the Chinese Han population samples, proving to be a reliable choice for the human sex estimation.