HL60-pNL3.2报告基因法在注射用脑蛋白水解物热原检测中的应用研究

摘要：目的:探讨HL60-pNL3.2报告基因法在注射用脑蛋白水解物热原检测中的应用。方法:参照2020年版中国药典细菌内毒素检查法（通则1143）,确定注射用脑蛋白水解物最小有效浓度。参照中国药典《体外热原检查法（报告基因法）》公示稿,干扰实验探讨脑蛋白水解物对热原测定是否存在干扰,并用本实验室建立的HL60-pNL3.2报告基因法对8个厂家生产的16批脑蛋白水解物进行热原测定。结果:注射用脑蛋白水解物最小有效稀释浓度为0.25 mg·ml-1。1 mg·ml-1浓度的脑蛋白水解物溶液对热原测定无干扰。用建立的方法对8个厂家生产的16批注射用脑蛋白水解物进行热原测定,结果均符合规定。结论:HL60-pNL3.2报告基因法具有不使用动物、操作简单、快速、检测热原谱广,可对热原进行定量的优点,可用于注射用脑蛋白水解物热原检测。     

溶菌酶纯度测定方法的建立

目的 建立反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定溶菌酶的纯度。方法 使用Agilent ZORBAX 300SB C₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);以三氟乙酸-水-乙腈(2∶700∶300)为流动相A,以三氟乙酸-水-乙腈(2∶200∶800)为流动相B,进行梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^-1,检测波长为280 nm,进样量为20 μL。并采用QE Plus质谱仪对其中单个最大杂质进行了相对分子质量测定。结果 建立的PR HPLC方法能够有效分离溶菌酶中主要杂质,主峰与各杂质峰均能较好分离,方法专属性强、溶菌酶在0.004～0.5 mg·mL^-1的内线性良好(r=1.000 0);定量限为0.08 μg,检出限为0.04 μg;精密度、重复性、20 h样品稳定性实验的相对标准偏差(RSD)值均小于0.5%;11批样品纯度测定结果为89%～94%;各样品中单个最大杂质峰中所含物质是相对分子质量不等的混合物。结论 建立的RP-HPLC方法可以用于溶菌酶纯度的检测。     

生物制品无菌制剂污染菌风险及无菌检查法培养条件调查

目的 调查中国药典无菌检查法中保留生物制品特殊培养条件的必要性。方法 对全国范围内的生物制品生产企业开展为期2年的产品和高等级洁净区中捕获污染菌种属和频数调查,并对污染菌培养条件进行核实。结果 在生产企业上报的有明确鉴定结果的污染菌中,未发现必须采用硫乙醇酸盐流体培养基低温(20~25 ℃)培养的需求。结论 从培养谱角度,在基于风险的前提下,建议中国药典无菌检查法对生物制品特殊培养要求进行修订。     

二氧化碳信号检测的快速微生物方法应用于细胞制品无菌检查的评估

目的:评价基于二氧化碳检测原理的BacT/ALERT 3D Dual-T?快速微生物检测系统作为药典无菌检查法的替代用于创新生物制品的可行性。方法:以细胞制品作为应用对象,参考各国药典及国外指导原则,研究快速方法在专属性、检测限、非劣效性方面是否可替代药典方法。结果:评价结果表明快速方法在专属性和检测限参数上达到了药典方法性能相当,大部分情况下可比药典方法更快地报告阳性结果,快速方法对产品质量的决策不劣于药典方法,且在数据完整性方面具备优势。结论:在风险管理的前提下,经验证的快速方法可作为药典无菌检查的替代方法用于创新生物制品的快速放行。     

中国药典2020年版无菌检查用隔离系统验证和应用指导原则修订概况

目的 介绍中国药典2020年版对无菌检查用隔离系统验证和应用规范的新要求。方法 分别从生命周期内的风险控制、关键性能特点、设备结构和安装要求、增修订确认项目及初次验证体系、应用注意事项等方面探讨中国药典2020年版中的新要求。结果 修订后的质量标准基于风险建立了更全面的规范。结论 中国药典2020年版可以更好地推进无菌隔离系统在制药实验室的规范应用。     

HPLC法结合LC-MS法测定硫酸鱼精蛋白含量及肽段鉴定

目的:建立了一种同时测定硫酸鱼精蛋白中主成分纯度和含量的HPLC方法，并采用LC-MS法对肽段氨基酸序列进行鉴定。方法:HPLC方法采用的色谱柱为ThermoHypersil GOLD色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),流动相A为0.1 mol·L^-1磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH至1.8),流动相B为乙腈-0.1 mol·L^-1磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH至1.8)(6.5∶93.5),梯度洗脱，流速1.0 mL·min^-1,柱温55℃,紫外检测波长为214 nm,进样量100μL。LC-MS法先采用馏分收集方式对各肽段进行提取富集，然后液质联用采用Waters ACQUITY UPLC Peptide BEH C₁₈色谱柱(15 cm×0.21 cm, 1.7μm),流速为0.2 mL·min^-1,流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为5%乙腈-0.1%甲酸溶液，梯度洗脱；Thermo Q-Exactive Plus, ESI离子源，阳离子检测模式，雾化电压为...     

离子色谱法同时测定醋酸阿托西班原料药及其注射液中的三氟乙酸与乙酸

建立了离子色谱法同时测定醋酸阿托西班(1)原料药及其注射液中的三氟乙酸(2)与乙酸(3)。采用Dionex IonPac^TM AS₂₃型阴离子柱(4 mm×25 cm,5μm)，以1.0 mmol/L碳酸氢钠溶液和4.0 mmol/L碳酸钠溶液为淋洗液，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，进样量为25μL。结果显示，2、3分别在0.03～11.53μg/mL、0.01～0.20 mg/mL内线性关系良好，定量限分别为1.4、5.1 ng，检测限分别为0.7、2.5 ng。1原料药中2和3的平均加样回收率(n=6)分别为100.9%、101.8%,RSD分别为0.60%、0.74%;1注射液中2和3的平均加样回收率分别为100.4%、101.5%,RSD(n=6)分别为0.86%、0.53%。建立的方法准确、灵敏度高、重复性好，可为1中2的用量控制以及2和3的同时测定提供科学依据。     

高效分子排阻色谱法测定抗毒素/抗血清类制品纯度

目的 建立高效分子排阻色谱法（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）测定抗毒素/抗血清类制品纯度，并应用该方法对52批样品进行测定。方法 采用TOSOH TSKgelG3000SWxl色谱柱，以含1%异丙醇，0.2 mol·L^-1磷酸盐缓冲液（pH 7.0）为流动相，流速0.6 mL·min^-1，检测波长280 nm，进样体积20 μL，柱温室温，按面积归一化法计算各组分相对百分含量。结果 选取抗毒素类和抗血清类制品各1批，在蛋白质浓度为1.2~24 mg·mL^-1时，主峰F（ab''）₂、大分子杂质峰和小分子杂质峰峰面积均与相应蛋白质浓度呈良好线性关系（n=5，r>0.999 0），重复性RSD均在0.4%~0.9%（n=6），主成分F（ab''）₂定量限分别为0.1 μg和0.2 μg，检出限分别为0.02 μg和0.1 μg，制备的供试品溶液在室温条件下12 h内各组分稳定性良好。结论 建立的HPSEC可用于抗毒素/抗血清类制品纯度的测定。     

CAR-T细胞治疗产品体外效力的检测策略与技术进展

随着嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T)等细胞治疗产品的应用走向成熟，其产品质量的检测方法也日渐受到关注。体外活力是评价细胞治疗产品有效性的重要方法，体外效力测定方法也以其简单、快速的特点，在产品放行过程中被广泛采用。本文从效应细胞及靶细胞这2个角度对CAR-T等细胞治疗产品体外效力测定方法进行综述。     

质谱技术在单克隆抗体类药物宿主细胞残留蛋白检测中的应用进展

单克隆抗体类药物是近年来生物制药领域增长率最快的一类生物技术药物，以其靶向性强、治疗效果明显等优势在癌症、自身免疫性疾病等领域应用广泛。宿主细胞残留蛋白（HCP）是其生产中无法去除且易引起免疫原性的一类工艺杂质，HCP含量测定是单抗药物质量控制中重要的一项指标。酶联免疫法（ELISA）是目前HCP检测最常用的方法，可以定量检测HCP的总量，但存在局限性。而质谱法作为一种高精密度高准确性的检测方法，已被应用于单克隆抗体类生物药物生产工艺中HCP的监测，可以与ELISA形成互补，弥补ELISA方法存在的不足，为生产条件优化、纯化效果验证提供了依据。文中将从样品前处理技术、分离技术以及数据采集技术3个方面介绍近年来质谱技术在单克隆抗体类药物HCP研究中的应用与进展，为后续质谱法应用于HCP检测研究提供了参考和指导。